酶法制備小黃魚下腳料調味料的風味前體物質

王 婧，胡夢欣，應苗苗，勵建榮,*

(1.浙江工商大學食品與生物工程學院，浙江省食品安全重點實驗室，浙江 杭州 310035；2.溫州科技職業學院食品所，浙江 溫州 325006)

酶法制備小黃魚下腳料調味料的風味前體物質

王 婧1，胡夢欣1，應苗苗2，勵建榮1,*

(1.浙江工商大學食品與生物工程學院，浙江省食品安全重點實驗室，浙江 杭州 310035；2.溫州科技職業學院食品所，浙江 溫州 325006)

以小黃魚下腳料為原料，利用酶解技術獲得小黃魚下腳料風味前體物質，通過單因素及響應面分析，確定堿性蛋白酶(Alcalase)和風味蛋白酶(Flavourzyme)同步酶解工藝，研究料水比、酶解時間、酶用量、初始pH值和酶解溫度對酶解液水解度和感官品質的影響。結果表明，優化的酶解工藝條件為料水比1:7(g/mL)、酶解溫度55℃、酶解時間6.5h、初始pH8.0、Alcalase用量2.5%、Flavourzyme用量3.0%。在此酶解條件下的水解度為40.11%，所得酶解液中氨基酸含量86.383g/100g，其中必需氨基酸32.785g/100g，鮮味和甘味氨基酸38.384g/100g，與酶解前相比氨基酸含量明顯增加，氨基酸總量增加了67.56%，其中必需氨基酸增加了82.02%，呈味氨基酸增加了79.52%，產品具有濃郁的小黃魚魚香味。

小黃魚下腳料；酶解；響應面分析；水解度

近年來，世界漁業產量幾乎停滯不前。漁業資源曾經被認為是取之不盡、用之不竭的，導致大量漁業廢棄物的丟棄，每年丟棄的廢棄物大約20萬噸(占總產量的25%)[1]，尤其像小黃魚等低值魚類其下腳料占魚體總量的40%左右，造成了嚴重的環境污染。盡管一些魚類下腳料被用來加工魚粉等產品，但是仍處于低水平重復利用狀態，造成大量營養成分(肽、氨基酸等)丟失[2]。因此，低值魚下腳料的增值開發利用顯得愈發重要。

酶解技術屬先進的風味提取技術，利用酶解技術制備小黃魚下腳料酶解液，不僅最大程度地保留了魚鮮味，而且還得到許多小肽、氨基酸等易于被人體吸收的營養成分和多種風味前體物質[3-4]。因此，以酶解液為基料，結合熱反應技術，配以調味輔料，制備風味鮮美、營養豐富、品種多樣的天然調味料，具有廣闊的市場前景。

本研究以小黃魚下腳料為原料，運用響應面分析法，采用Alcalase和Flavourzyme同步酶解技術，優化小黃魚下腳料中風味前體物質制備工藝，獲得富含氨基酸、多肽的小黃魚下腳料酶解液。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小黃魚下腳料(頭、內臟) 瑞安市華忠水產食品有限公司；甲醛(分析純) 上海申翔化學試劑有限公司；Alcalase(食品級)、Flavourzyme(食品級) 諾維信(中國)生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

LGJ-1冷凍干燥機 上海醫用分析儀器廠；Kjeltec 2300凱式定氮儀 福斯分析公司；L-8900氨基酸自動分析儀 日本日立公司；DELTA 320 pH計 梅特勒-托利多儀器有限公司；07HWS-2數顯電熱恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；HH-2數顯恒溫磁力攪拌器 杭州通用電子儀表廠。

1.3 方法

1.3.1 酶解原料制備

小黃魚下腳料→解凍→勻漿→冷凍干燥→超微粉碎→真空包裝(備用)

1.3.2 酶解工藝路線[5]

原料→加水勻漿→一定溫度、pH值條件下，加酶反應一定時間→85℃滅酶20min→冷卻→離心(9000r/ min，20min)→傾出酶解液，備用

1.3.3 水解度(degree of hydrolysis，DH)的測定

上清液氨基態氮通過甲醛電位滴定法[6]測定，總氮通過凱式定氮法測定。

1.3.4 響應面分析

根據Box-Bohnken中心組合設計原理，對影響小黃魚下腳料水解度的4個因素各取3個水平，進行響應面分析試驗。

1.3.5 數據分析

采用SPSS 13.0軟件及SAS程序對結果進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 酶的初步選擇

本研究分別選用Trypsin、Pepsin、Papain、 Flavourzyme、Protamex、Alcalase對小黃魚下腳料進行酶解，在參考所選酶的最適酶解條件及預實驗基礎上，選取料水比為1:5(g/mL)、酶用量(酶與底物質量比)2%、酶解時間3h、pH7.0、酶解溫度55℃條件下，比較各蛋白酶對小黃魚下腳料水解度和感官評價的影響。其中，Pepsin酶解pH2.5、酶解溫度40℃[7]。

如表1所示，在同樣的酶解時間下，Alcalase水解度較高，效果較好。從酶解液風味來說，Papain風味最差，有木瓜和魚腥混合的異味，Trypsin和Pepsin酶解液腥味較大，Flavourzyme酶解液風味最好。單酶酶解時可采用Alcalase或Flavourzyme。Alcalase是一種內切絲氨酸蛋白酶，在海洋性生物資源利用(尤其是酶解魚類蛋白)上具有顯著的優越性[8]；而Flavourzyme是外切蛋白酶和內切蛋白酶的混合物，可用于脫除酶解液的苦味，改善和增進酶解液的風味[9]。

表1 幾種蛋白酶對小黃魚下腳料的酶解效果Table1 Comparison of single enzyme hydrolysis of small yellow croaker scraps with different proteases

2.2 Alcalase和Flavourzyme單因素試驗結果

為進一步考察酶對蛋白質水解結果的影響，采用單因素試驗分別對兩種酶的酶解條件進行分析，包括料水比、酶解時間、酶用量、酶解pH值和酶解溫度。結果表明，Alcalase最適酶解條件為料水比1:7(g/mL)、酶解時間4h、酶用量2.5%、初始pH9.0和酶解溫度55℃。采用相同的料水比1:7(g/mL)，Flavourzyme對蛋白質的最適酶解條件為酶解時間2.5h，酶用量2.0%，初始pH7.5，酶解溫度55℃。

2.3 酶種類和加入順序的優化[6,10-11]

固定料水比為1:7(g/mL)時，Alcalase和Flavourzyme在最適酶解條件下，分別對兩種酶的加入方式進行比較研究，如圖1所示。實驗結果表明，相對于Flavourzyme，Alcalase對蛋白質的水解度更高。據文獻報道，以內切蛋白酶Alcalase啟動水解，可給外切-內切蛋白酶混合物Flavourzyme提供更多的作用位點[12]；而另一方面，Flavourzyme的加入能進一步改善酶解液的風味[13]。因此，實驗還比較了兩種酶同時加入或先后加入的方式對蛋白質酶解結果的影響，發現兩種酶同時加入或先加入Alcalase后加入Flavourzyme的方式的酶解效果均較好，水解度最高達35.04%。綜合考慮到水解度、酶解液風味及酶解工藝等因素，選擇Alcalase和Flavourzyme同步酶解為最適酶解條件。運用SPSS 13.0軟件進行方差分析，得到P＜0.05，如表2所示，證明各因素間有顯著性差異。

圖1 酶解方式對小黃魚下腳料酶解效果的影響Fig.1 Effect of hydrolysis mode on the DH of small yellow croaker scraps

表2 各因素影響的方差分析結果Table2 Variance analysis for the DH of small yellow croaker scraps with different hydrolysis modes

2.4 同步酶解時間的確定

圖2 同步酶解時間對水解度的影響Fig.2 Effect of one-step double enzymatic hydrolysis duration on the DH of small yellow croaker scraps

在料水比1:7(g/mL)、酶解溫度55℃、初始pH7.5、Alcalase添加量2.5%、Flavourzyme添加量2%條件下，分別酶解2、3、4、5、6、7、8 h，測樣品的水解度，結果見圖2。從圖2可以看出，當酶解時間在2～6h時，隨著酶解時間延長，水解度顯著增加，6h以后，趨于平衡，水解度略有下降。這一方面可能是隨著酶解反應的進行，體系pH值發生改變，底物濃度降低，造成酶活力的逐漸下降；另一方面可能是酶解產物的反饋抑制作用所致[14]。隨酶解時間的延長，樣品中的蛋白質不斷降解為易于人體吸收的小分子肽和氨基酸。酶解到一定程度，酶解液會出現苦味物質，這與酶解過程中產生的疏水性氨基酸有關[15]。綜合考慮經濟和風味因素，選定6h為最適反應時間。

2.5 同步酶解初始pH值的選擇

酶解pH值對酶催化反應的影響包括兩個方面，一是影響酶的穩定性，二則影響酶與底物的結合以及酶催化底物轉變成產物。酶解初始pH值過高或過低，均會影響酶的作用效果。結合兩種酶的單因素試驗結果，選定5個不同水平(初始pH5.5、6.5、7.5、8.5、9.5)考察不同初始pH值對同步酶解效果的影響，結果如圖3所示。從圖3可知，初始pH值在5.5～8.5范圍內上升，水解度不斷增加；當pH值大于8.5時，水解度下降，由此可知，同步酶解的最適作用初始pH值為8.5。

圖3 復同步酶解初始pH對水解度的影響Fig.3 Effect of initial pH on the DH of small yellow croaker scraps

2.6 采用響應面法優化小黃魚下腳料的同步酶解工藝

2.6.1 分析因素的選取及分析方案[16]

根據Box-Benhnken模型的中心組合試驗設計原理[17]，綜合2.2節Alcalase和Flavourzyme單因素試驗結果，兩種酶的料水比與酶解溫度相同，故這里選取小黃魚下腳料樣品的酶解時間、酶解初始pH值、Alcalase用量、Flavourzyme用量4個因素為自變量，水解度為響應值，試驗因素水平設計及結果如表3、4所示。

表3 響應面試驗因素水平表Table3 Factors and levels in the response surface design

表4 響應面分析結果Table4 Response surface design matrix and experimental results

2.6.2 模型的建立與顯著性檢驗

利用SAS-RSREG程序對響應值和各因素進行多元回歸擬合后，得到二次多項回歸方程：DH/%＝35.53－1.51A＋0.23B－0.14C－1.60D－1.37AB－0.27AC－0.14AD＋0.15BC－1.10BD－0.27CD－1.49A2－0.66B2－0.80C2－1.07D2

回歸方程是模擬4個因素與水解度之間的關系，對回歸方程系數顯著性檢驗表及方差分析，可知模型對試驗擬合良好，模型的P=0.0463＜0.05，表明該試驗模型顯著。失擬項P=0.1421＞0.05，說明方程對試驗的擬合度較好，此方法可靠，故可用回歸方程代替實驗真實點對實驗結果進行分析[18]。將回歸方程的各項回歸系數進行t檢驗，發現A、D、A2因素顯著(P＜0.05)，說明響應值的變化比較復雜，各具體試驗因素對響應值的影響不是簡單的線性關系。

2.6.3 響應面分析圖

響應面分析的圖形是響應值對各試驗因素所構成的三維空間曲面圖，它直觀地反映了各因素交互作用對響應值的影響。如圖4所示，酶解時間和兩酶的交互作用，初始pH值和Alcalase的相互作用，Alcalase和 Flavourzyme的交互作用都比較顯著。而初始pH值與Flavourzyme用量、酶解時間的交互作用不顯著。在酶用量一定的條件下，水解度隨著酶解時間的延長而增加，但過長的酶解時間反而使水解度略有下降。這與2.4節結果相符。

圖4 各因素間的相關性對水解度的影響Fig.4 Response surface plots showing the pairwise interactive effects of four hydrolysis conditions on the DH of small yellow croaker scraps

2.6.4 最佳酶解條件

通過SAS-RSREG程序嶺脊分析得到小黃魚下腳料的的最佳酶解條件，即料水比1:7(g/mL)、酶解溫度55℃、酶解時間6.59h、初始pH7.99、Alcalase用量2.38%、Flavourzyme用量2.93%。在此最優工藝條件下水解度的理論值為37.19%?？紤]到實際操作，將小黃魚下腳料的酶解工藝修正為料水比1:7(g/mL)、酶解溫度55℃、酶解時間6.5h、初始pH8.0、Alcalase用量2.5%、Flavourzyme用量3%。為檢驗RSM法的可靠性，在此條件下做3次平行驗證實驗，實際測得小黃魚下腳料水解度為40.11%，與理論預測值基本相符，說明該回歸方程能較真實地反映各因素對小黃魚下腳料酶解效果的影響情況。

2.7 小黃魚下腳料酶解前后的氨基酸成分分析比較

表5 酶解前后體系的游離氨基酸變化Table5 Change in free amino acid composition of small yellow croaker scraps before and after the optimized hydrolysis

酶解小黃魚下腳料后，酶解液中富含豐富的游離氨基酸(表5)。其中，必需氨基酸含量(32.785g/100g)占氨基酸總量(86.383g/100g)的37.95%；呈鮮味特征性氨基酸天門冬氨酸(8.006g/100g)和谷氨酸(16.555g/100g)，呈甘味特征性氨基酸丙氨酸(6.380g/100g)和甘氨酸(7.443g/100g)，這4種呈味氨基酸[19]占氨基酸總量的44.43%；苦味氨基酸[14,20]亮氨酸(8.344g/100g)、組氨酸(1.724g/100g)、異亮氨酸(3.634g/100g)、纈氨酸(4.252g/100g)、甲硫氨酸(2.628g/100g)、精氨酸(0.564g/100g)和苯丙氨酸(3.778g/100g)占氨基酸總量的28.85%。與酶解前小黃魚下腳料中的氨基酸含量相比，氨基酸總量增加了67.56%，必需氨基酸含量增加了82.02%，天門冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸和甘氨酸這4種呈味氨基酸增加了79.52%。值得注意的是，小黃魚下腳料經酶解后，其苦味氨基酸的含量由32.09%略降至28.85%。因此，小黃魚下腳料的酶解液營養豐富，具有濃郁的鮮香味，苦味較小，是較為理想的水產調味料基料。

3 結 論

通過酶的篩選實驗，初步選定了對小黃魚下腳料酶解效果較好的堿性蛋白酶和風味蛋白酶作為水解酶。進一步通過單因素和響應面分析確定了A l c a l a s e和Flavourzyme同步酶解的最優條件：料水比1:7(g/mL)、酶解溫度55℃、酶解時間6.5h、初始pH8.0、堿性蛋白酶用量2.5%、風味蛋白酶用量3.0%。在此條件下，水解度達到40.11%。該值比響應面模型的預測值37.19%高一些，說明響應面模型可優化酶解工藝條件。酶解液鮮味明顯，略有苦味，氨基酸含量為86.383g/100g，其中必需氨基酸含量為32.785g/100g，可作為良好的水產調味料反應基料。酶解液的苦味可通過水產調味料的后續加工過程，如酸調、熱反應等方法去除，相關工作正在開展。

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Enzymatic Hydrolysis of Small Yellow Croaker Scraps for Preparing Flavor Precursors

WANG Jing1，HU Meng-xin1，YING Miao-miao2，LI Jian-rong1,*
(1. Food Safety Key Laboratory of Zhejiang Province, College of Food Science and Biotechnology, Zhejiang Gongshang University, Hangzhou 310035, China；2. Food Research Institute, Wenzhou Vocational College of Science and Technology, Wenzhou 325006, China)

Small yellow croaker scraps were enzymatically hydrolyzed to obtain flavor precursors. The simultaneous use of alcalase and flavourzyme was found to be the best choice for the production of flavor precursors with higher degree of hydrolysis (DH), and the hydrolysis conditions including material/liquid ratio, hydrolysis duration, enzyme dosage, initial pH and hydrolysis temperature were optimized by single factor method and response surface methodology based on Box-Benhnken experimental design. The optimized values of the four hydrolysis conditions were determined as follows: material/liquid ratio, 1:7; hydrolysis temperature, 55 ℃; initial pH, 8.0; alcalase dosage, 2.5%; and ourzyme dosage, 3.0%. Under these conditions, the DH was 40.11%, and the contents of total amino acids, essential amino acids and four delicious amino acids in the obtained hydrolysate were 86.383, 32.785 g/100 g and 38.384 g/100 g, increasing by 67.56 %, 82.02 % and 79.52% in comparison with those of the start material, respectively. Moreover, the obtained hydrolysate had a strong flavor of small yellow croaker.

small yellow croaker scraps；enzymolysis；response surface methodology；degree of hydrolysis

TS254.9；TS264.9

A

1002-6630(2010)20-0037-06

2010-01-09

浙江省溫州市海洋與漁業局項目

王婧(1985—)，女，碩士研究生，研究方向為食品加工與制造。E-mail：751285696@qq.com

*通信作者：勵建榮(1964—)，男，教授，博士，研究方向為食品加工與安全。E-mail：lijianrong@zjgsu.edu.cn