玫瑰花中總黃酮提取工藝及其抗氧化與抑菌作用的研究

周小琦，方 敏，宮智勇,*

(1.武漢工業學院食品科學與工程學院，湖北 武漢 430023；2.華中科技大學同濟醫學院公共衛生學院營養與食品衛生學系，湖北 武漢 430030)

玫瑰花中總黃酮提取工藝及其抗氧化與抑菌作用的研究

周小琦1,2，方 敏1，宮智勇1,*

(1.武漢工業學院食品科學與工程學院，湖北 武漢 430023；2.華中科技大學同濟醫學院公共衛生學院營養與食品衛生學系，湖北 武漢 430030)

通過單因素以及正交試驗，對玫瑰花干花蕾中總黃酮的提取工藝進行研究。確定玫瑰花總黃酮的最佳提取工藝：提取溶劑為體積分數75%的乙醇、溫度80℃、料液比1:25(g/mL)、提取時間3h，此時玫瑰花總黃酮含量為4.538g/100g。采用DPPH法測定玫瑰花總黃酮提取液清除DPPH自由基的能力，結果顯示：它對DPPH自由基的清除率達到90.23%。采用牛津杯法做抑菌實驗，結果表明玫瑰花總黃酮提取液對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌均有很好的抑菌效果。

玫瑰花；黃酮；抗氧化；抑菌

玫瑰，薔薇科薔薇屬落葉叢生灌木。玫瑰花有很高的經濟價值，一般用來提煉精油和色素。玫瑰花成分復雜，含有多酚類、黃酮類等多種化學成分[1-2]。這些化學成分有減少和消除自由基、抗氧化活性、抗血栓、抗癌、抗炎、抑菌、免疫調節作用、降血脂和預防心臟病等生理活性[3]。

本實驗采用酸性乙醇提取法[4-5]提取玫瑰花干花蕾中的生物活性物質——黃酮，旨在探討該方法提取的最佳條件，為玫瑰花中活性物質的提取提供參考。同時初步研究黃酮提取液對DPPH自由基的清除能力以及對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑菌作用，旨在為進一步開發利用玫瑰花提供可靠的科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玫瑰花干花蕾 市購；抑菌培養基：牛肉膏蛋白胨培養基(牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L、氯化鈉5g/L、pH7.0～7.2)；供試菌種：金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) 華中農業大學菌種試驗中心；無水乙醇、檸檬酸、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉(均為分析純)；蘆丁標準品、DPPH美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

7200可見分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司；Ar2140型電子天平 沈陽龍騰電子有限公司；HH-2數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；SHZ-D(Ⅲ)型循環水式真空泵 鞏義市英峪予華儀器廠；移液槍10～100μL 大龍醫療設備(上海)有限公司；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司；DNP-9082型電熱恒溫培養箱 上海精密試驗設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 材料處理

市售的玫瑰花干花蕾用萬能粉碎機粉碎，過20目篩，置于干燥器中備用。

1.3.2 蘆丁標準溶液的配制和標準曲線繪制

采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法，按照文獻[6-7]方法操作，利用分光光度計在波長510nm處、以1cm比色皿、試劑空白為參比，測定吸光度A值。以A為橫坐標，質量濃度C為縱坐標，繪制蘆丁標準曲線如圖1所示，其線性回歸方程為：C= 2.8779A－0.1026，R2= 0.9978。

圖1 蘆丁樣品標準曲線Fig.1 Standard curve of rutin

1.3.3 玫瑰花中總黃酮含量的提取及測定

精密稱取玫瑰花粉末2.00g，用50mL 65%(V/V)乙醇-5%(V/V)檸檬酸溶液(簡稱為酸性乙醇)在溫度80℃下連續回流提取2.5h，趁熱抽濾，濾液轉入50mL容量瓶中用65%酸性乙醇定容至刻度，即為所得的總黃酮提取液[8]。精密稱取樣品溶液0.4mL置于10mL容量瓶中，按照繪制標準曲線的方法操作，測定吸光度，代入回歸方程，計算玫瑰花中總黃酮的含量。計算公式為：

式中：C為從回歸方程求得的蘆丁含量/(mg/10mL)；V1為樣液總體積/mL；V為測定取樣體積/mL；m為樣品質量/g。

1.3.4 玫瑰花總黃酮提取的單因素試驗和正交試驗

首先擬定溫度、提取時間、乙醇體積分數和料液比[9]進行單因素試驗。在單因素試驗的基礎上確定正交試驗工藝參數范圍，采用L9(34)正交試驗設計，并進行方差分析確定玫瑰花黃酮提取的最佳工藝。

1.3.5 玫瑰花抗氧化作用的測定

DPPH法是利用DPPH溶液的特征紫紅色團的吸收峰，以分光光度法測定加抗氧化劑或植物提取液后A525nm吸收的下降表示其對有機自由基清除能力[10]。參考Larrauri等[11-12]，對文獻[8]方法略作改進，測定1.3.4節所得最優方案的提取液清除DPPH自由基的能力，為消除檸檬酸對玫瑰花提取物的抗氧化能力的影響[4,13]，以不加檸檬酸的玫瑰花總黃酮提取液作為對比。樣品各重復3次平行實驗。提取液對DPPH自由基的清除率K可用下式計算：

K/%=[1－(Ai－Aj)/Ac]×100

式中：Ai= 4mL DPPH溶液＋40μL玫瑰花提取液吸光度；Aj= 40μL玫瑰花提取液吸光度＋4mL 50%乙醇的吸光度；Ac=4mL DPPH溶液＋40μL蒸餾水的吸光度。

1.3.6 抑菌實驗

將由最優方案得到的玫瑰花總黃酮提取液在75℃下加熱使乙醇揮發完全，加蒸餾水定容至50mL，即為玫瑰花黃酮提取液，以不加黃酮類化合物為對照，過濾除菌備用。用移液器分別吸取金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌兩種菌懸液各200μL，均勻涂布在倒好的已滅菌培養基平皿上。在培養皿中放入無菌牛津杯。用移液器取黃酮提取原液200μL，加入標有記號的牛津杯中，重復3次，以無菌蒸餾水和5%(V/V)檸檬酸溶液[14]作對照。置37℃恒溫培養箱培養24h，測定抑菌圈直徑，計算平均值[15]。

2 結果與分析

2.1 玫瑰花總黃酮提取的單因素試驗結果

2.1.1 料液比對總黃酮提取效果的影響

圖2 料液比對玫瑰花總黃酮提取效果的影響Fig.2 Effect of material/liquid ratio on extraction rate of total flavonoids from rose

分別用不同的料液比1:10、1:20、1:25、1:40(g/mL)，按1.3.3節操作步驟，以65%酸性乙醇為提取劑，在80℃回流提取2.5h，料液比對玫瑰花總黃酮含量提取效果的影響如圖2所示。

從圖2可以看出，玫瑰花總黃酮含量隨溶劑量的增加先升高后降低，并在料液比為1:20(g/mL)時總黃酮含量最高。這可能是因為溶劑量比較小時，玫瑰花細胞破碎程度比較好，雖然溶劑量較少，但溶出的黃酮較多，故選擇最適料液比為1:20(g/mL)。

2.1.2 提取時間對提取效果的影響

分別用不同的提取時間2、2.5、3、4h，按1.3.3節操作步驟，以65%酸性乙醇為提取劑，回流提取溫度80℃，料液比1:20(g/mL)，提取時間對玫瑰花總黃酮含量提取效果的影響如圖3所示。

圖3 提取時間對玫瑰花總黃酮提取效果的影響Fig.3 Effect of extraction time on extraction rate of total flavonoids from rose

從圖3可以看出，提取時間為3h時玫瑰花黃酮提取效果最好，隨著提取時間的延長，黃酮含量有下降趨勢，這可能是因為隨時間增加，玫瑰花中其他雜質也會浸出，并且乙醇揮發量增多，總黃酮含量也會有所降低。因此，提取時間以3 h為宜。

2.1.3 提取溫度對提取效果的影響

分別用不同的溫度60、70、80、90℃，按1.3.3節操作步驟，以65%酸性乙醇為提取劑，回流提取2.5h，料液比1:20(g/mL)時，提取溫度對玫瑰花總黃酮含量提取效果的影響如圖4所示。

圖4 溫度對玫瑰花總黃酮提取效果的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on extraction rate of total flavonoids from rose

從圖4可以看出，提取溫度為80℃時，就可以達到比較好的效果，盡管溫度繼續升高使提取出總黃酮含量稍有提高，但考慮到溫度太高可能會使黃酮發生氧化，并且增加能耗，確定提取溫度80℃較為適宜。

2.1.4 酸性乙醇體積分數對提取效果的影響

分別用不同的酸性乙醇體積分數4 5%、5 5%、65%、75%，按1.3.3節操作步驟，在80℃回流提取2.5h，料液比1:20(g/mL)，酸性乙醇體積分數對玫瑰花總黃酮含量提取效果的影響如圖5所示。

圖5 酸性乙醇體積分數對玫瑰花總黃酮提取效果的影響Fig.5 Effect of ethanol concentration on extraction rate of total flavonoids from rose

根據圖5可知，當酸性乙醇體積分數在45%～65%之間時，玫瑰花中提取出的黃酮含量隨乙醇體積分數的增加而升高，說明酸性乙體積分數較低時不足以浸提出大多數黃酮類物質，而隨著乙醇體積分數的進一步升高，提取的總黃酮含量并沒有升高而呈下降趨勢，這可能是因為酸性乙醇體積分數過高則葉綠素等脂溶性物質的溶出量也增多，不利于總黃酮的提純。因此，確定玫瑰花提取的酸性乙醇體積分數為65%。

2.2 玫瑰花總黃酮提取的正交試驗結果

以溫度、提取時間、料液比、乙醇體積分數4個因素進行正交試驗設計，確定玫瑰花中總黃酮提取的最佳條件，試驗因素水平見表1，試驗結果見表2。

表1 正交試驗因素水平表Table1 Factors and levels in the orthogonal array design

從表2試驗結果可以看出：極差分析為D＞C＞A＞B，提取玫瑰花中總黃酮的最佳條件為A2B3C2D3，即酸性乙醇體積分數75%、溫度80℃、料液比1:25(g/mL)、提取時間3h。驗證實驗結果表明：總黃酮含量可達4.538g/100g。

表2 玫瑰花L9(34)正交試驗結果Table2 Orthogonal array design layout and experimental results

2.3 玫瑰花對DPPH自由基的清除作用

按1.3.5節測得吸光度Ai、Aj及DPPH自由基清除率結果(Ac=1.372)如表3所示。由表3可以看出，玫瑰花有較好的清除自由基作用，且添加檸檬酸提取與否對其自由基清除能力影響不大，說明天然氧化劑檸檬酸對玫瑰花的抗氧化性可能有一定的協同作用，但作用不大。

表3 玫瑰花對DPPH自由基的清除能力Table3 Scavenging capacity of ethanol extract from rose on DPPH free radicals

2.4 玫瑰花總黃酮抑菌實驗結果

玫瑰花總黃酮提取液(質量濃度為0.182g/100mL)的抑菌結果見圖6，抑菌圈大小測量結果見表4。

圖6 玫瑰花總黃酮提取液對金黃色葡萄球菌(A、B、C)和枯草芽孢桿菌(D、E、F)的抑制效果Fig.6 Inhibitory effect of total flavonoids from rose on S. aureus and B. subtilis

表4 玫瑰花總黃酮提取液的抑菌結果Table4 Inhibitory effect of total flavonoids from rose on bacteriacm

表4結果表明：消除檸檬酸的影響后，玫瑰花總黃酮提取液對金黃色葡萄球菌產生的抑菌圈直徑為1.70cm，對枯草芽孢桿菌產生的抑菌圈直徑為1.10cm。一般認為抑菌圈小于1.3cm為低度抑菌、1.3～1.9cm為中度抑菌、大于1.9cm為高度抑菌[11]。由表4可見，玫瑰花總黃酮對金黃色葡萄球菌為中度抑菌，而對枯草芽孢桿菌為低度抑菌。

3 結 論

對玫瑰花總黃酮提取工藝進行探討，得出提取玫瑰花中總黃酮的最佳條件是：酸性乙醇體積分數75%、溫度80℃、料液比1:25(g/mL)、提取時間3h。利用該法得到的玫瑰花總黃酮提取液進行抗氧化及抑菌實驗，結果提取液對DPPH自由基具有較好的清除作用，清除率達到90.23%，同時提取液對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌均表現出較好的抑菌效果。

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Extraction, Antioxidant Activity and Antibacterial Effect of Total Flavonoids from Rose Flowers

ZHOU Xiao-qi1,2，FANG Min1，GONG Zhi-yong1,*
(1. College of Food Science and Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China；2. Department of Nutrition and Food Hygiene, School of Public Health, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China)

On the basis of single factor and orthogonal array experiments, the optimal process for the extraction of total flavonoids from rose was explored. The optimal extraction conditions were found to be: extraction solvent, 75% ethanol; extraction temperature, 80 ℃; extraction duration, 3 h; and material/solvent ratio of 1:25. The scavenging capacity of ethanol extract from rose on DPPH free radicals was up to 90.23%. Meanwhile, strong antibacterial effect of ethanol extract from rose against Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis were also observed through Oxford Cup experiments.

rose；flavonoid；antioxidant activity；antibacterial effect

O623.54

A

1002-6630(2010)20-00102-04

2010-01-19

周小琦(1986—)，女，碩士研究生，研究方向為食品安全。E-mail：pretty8619@yahoo.com.cn

*通信作者：宮智勇(1966—)，男，副教授，博士，研究方向為食品營養與毒理。E-mail：zhiyong_gong@yahoo.com.cn