高速逆流色譜分離制備茶粕中茶皂素單體

陳 力，鄧澤元，胡蔣寧*，李 靜，范亞葦，劉 蓉

(南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047)

高速逆流色譜分離制備茶粕中茶皂素單體

陳 力，鄧澤元，胡蔣寧*，李 靜，范亞葦，劉 蓉

(南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047)

目的：建立一種高效、快速的分離制備茶皂素單體的高速逆流色譜方法。方法：微波輔助提取茶皂素后，用D-101大孔樹脂初步純化，所得粗品經高速逆流色譜分離純化，乙酸乙酯-正丁醇-水(1:4:4，V/V，含體積分數3%的乙酸)為兩相溶劑系統，轉速800r/min、流速1.5mL/min、檢測波長267nm、進樣量100mg，所得分離收集液經高效液相色譜法檢測。結果：從茶皂素粗提物中分離得到純度分別為99.1%和94.5%的兩種茶皂素單體，經干燥稱得其質量分別為11mg和15mg。結論：該方法制備茶皂素單體簡便、快速，所得產物的純度高，為茶皂素的分離純化提供了一種新途徑。

高速逆流色譜(HSCCC)；茶皂素單體；制備；純化

茶粕，又稱茶籽餅，呈紫褐色顆粒，是野山茶油果實榨油后所剩的渣。茶粕中含有11%～13%的茶皂素。茶皂素又名茶皂苷，是一種純天然非離子型表面活性劑。目前，茶皂素已廣泛用于各行業中。在農藥上，茶皂素可以作為農藥濕潤劑、增效劑或直接用于殺蟲劑、殺菌劑、殺螨劑；在紡織業上，茶皂素對蛋白質纖維無損傷，其優良的去污、起泡、穩泡等多種功能，使其在對絲織物等的洗滌方面具有優越性；在醫藥上，茶皂素具有其他表面活性劑所沒有的抗滲、消炎、鎮痛、抗癌等藥理功能；在養殖業上，利用茶皂素的溶血和魚毒作用，可殺死有害魚類，但對蝦無影響，用于蝦養殖的清池劑；在建筑上，茶皂素可以作為加氣混凝土的氣泡穩定劑；在日用化工上，利用茶皂素的表面活性作用，可用于洗發劑和洗面劑等；在食品行業上，作為發泡劑、穩泡劑應用于啤酒生產[1]。

目前，對茶皂素的提取大多采用水提法[2]、有機溶劑法[3]、超濾膜法[4]等，這些方法不同程度地存在得率低、提取時間長、能耗大、純度低等不足，本研究采用微波輔助提取、高速逆流色譜(high-speed countercurrent chromatography，HSCCC)純化茶皂素單體。高速逆流色譜是一種新型的液-液分配色譜技術，在短時間內實現樣品在互不相溶的兩相溶劑系統中的高效分配，從而實現樣品分離。HSCCC最大的優點在于每次的進樣量比較大，可以達到毫克量級，甚至克量級；同時，由于不需要固體支撐物，因而避免了固體固定相不可逆吸附而引起的樣品損失、失活、變性等問題，樣品回收率高[5]。目前，國內外還未見HSCCC分離制備茶皂素的文獻報道。本實驗采用高速逆流色譜對茶粕中的茶皂素單體進行純化，優化最佳的分離純化條件，為茶皂素單體的理化性質和生物學作用研究提供純品。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油茶餅粕 江西省宜春市青龍高科技股份有限公司；茶皂素對照品(純度>80%) 上海融禾醫藥科技發展有限公司；乙腈、甲醇為色譜純；乙酸乙酯、正丁醇等均為分析純。

1.2 儀器與設備

TBE-300A型高速逆流色譜儀 上海同田生化技術有限公司；AKTA Purifier100蛋白質純化系統(配有UV900檢測器、UNICORN 5.10工作站) 瑞士Amersham公司；1100高效液相色譜儀(配有DAD檢測器) 美國安捷倫公司；FW135手提式高速中藥粉碎機 溫嶺市大德中藥機械有限公司；RE-85Z旋轉蒸發儀 鞏義市英峪予華儀器廠；BSZ-自動部分收集器 上海青浦滬西儀器廠；格蘭仕微波爐。

1.3 方法

1.3.1 茶皂素粗提物的制備

茶粕干燥后粉碎過篩，用兩倍體積的石油醚加熱回流脫脂。稱取50g預處理后的茶粕粉末，加入一定量的傳熱介質，以加熱功率為800W，55%微波＋45%光波輻射，時間為2min進行微波預處理后，加入80%乙醇浸提數分鐘，過濾。重復操作3次，合并濾液，濃縮揮干乙醇后用水飽和的正丁醇萃取，萃取液經減壓濃縮至干得到粗茶皂素。

1.3.2 茶皂素粗品的初步純化

采用D-101大孔樹脂初步純化。配制粗茶皂素含量為20mg/mL左右的上樣液，以1BV/h的流速動態上樣，上樣量為3～4BV。上樣吸附后先用水洗至Molish反應呈陰性，再用70%的乙醇溶液進行洗脫，收集流出液，旋干，用于進一步分離實驗。

1.3.3 高速逆流色譜溶劑系統的選擇

根據相關文獻[6-9]及茶皂素極性，選取幾種溶劑系統，通過測定分配系數K和分層時間來進行篩選。

將所選的溶劑系統在分液漏斗中充分混勻，靜置過夜使其分配平衡。再用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)測定分配系數K：取分配平衡的兩相溶劑系統的上、下相各3mL，加入茶皂素粗品，漩渦振蕩，使其在兩相溶劑中的分配達到平衡。取等體積的上、下相溶液，減壓旋轉蒸發器蒸干；分別用甲醇溶解經HPLC法測定分析其峰面積，計算分配系數K：

K= A1/A2

式中：K為分配系數；A1為上相峰面積/(μV·s)；A2為下相峰面積/(μV·s)。

HPLC測定條件：色譜柱：Agilent ODS C18column (250mm×4.6mm，5μm)；柱溫：20℃；進樣量：10μL；檢測波長：267nm，參考波長：350nm，流動相：乙腈-水；采用梯度洗脫，梯度為：0～20min時，乙腈體積分數逐漸由20%變為15%，20～25min，乙腈體積分數再由15%變為20%；流速：0.5mL/min。

兩相溶劑體系分層時間的測定：取分配平衡的溶劑系統的上相和下相2mL，漩渦振蕩后開始計時，直至兩相完全分開，計算時間。反復數次得平均值。

1.3.4 高速逆流色譜分離純化茶皂素

用分液漏斗配制一定比例的兩相溶劑體系，充分振搖后靜置過夜，分離上下相，兩相分別超聲脫氣30min。稱取100mg樣品，用3mL下相溶解離心，作為樣品溶液。以上相為高速逆流色譜的固定相，下相為流動相。開啟恒溫循環裝置使溫度保持在30℃，將固定相以15mL/min的流速泵入高速逆流色譜儀的分離柱中，待固定相充滿管道后，啟動高速逆流色譜儀主機，調節轉速，順時針旋轉。以一定的流速泵入流動相。當流動相從分離柱出口流出約30mL時，兩相體系已經在高速逆流色譜的分離柱中達到流體動力學平衡。此時將分離柱出口與紫外檢測器及色譜工作站連接，開啟紫外燈，待基線平穩后將樣品溶液注入進樣環中，在267nm波長處進行檢測，根據色譜圖的出峰情況自動收集流出組分。1.3.5分離物的鑒定

對茶皂素對照品、茶皂素粗品和經HSCCC分離純化所收集的樣液進行HPLC圖譜分析。并向茶皂素粗品中加入茶皂素對照品后進行HPLC分析鑒定。HPLC條件同1.3.3節。

2 結果與分析

2.1 溶劑系統的選擇

在高速逆流色譜中，溶劑體系的選擇至關重要。主要應考慮溶劑對分離物質的溶解性、分配系數K、分離因子α、分層時間、分離過程中固定相保留率等。對HSCCC最合適的K值范圍是0.5～2，當K＜＜0.5時，目標化合物與雜質峰重疊無法分離；當K＞＞2時，會使分離時間延長，峰展寬現象嚴重，目標化合物的純度降低[10]。分離因子α應在1.5～2之間為好。另外，溶劑系統的乳化會將固定相帶出，因此其分層時間應小于30s[11]。

本實驗中，根據文獻和經驗，采用了4種不同的溶劑系統，再根據實驗結果調節其配比系數比來優化溶劑系統。結果發現，由于茶皂素是一種很強的表面活性劑，會造成嚴重的乳化，因此在溶劑體系中加入少量乙酸來改善乳化現象。4種溶劑體系的分配系數及分離因子列于表1。

表1 不同溶劑體系的分配系數、分離因子和分層時間Table1 Partition coefficients (K values), separation factors (α) and settling time in different two-phase solvent systems

圖1 不同溶劑系統的茶皂素提取物HSCCC譜圖Fig.1 HSCCC profiles of teasaponin monomers obtained with different solvent systems

從表1可知，以正己烷-正丁醇-水(含3%乙酸)作溶劑系統時，分配系數太小，會使各色譜峰擁擠在一起；以氯仿-甲醇-正丁醇-水(含3%乙酸)作溶劑系統時，分配系數太大，峰展寬嚴重，會降低目標產物的純度。乙酸乙酯-正丁醇-乙醇-水(含3%乙酸)體系的分配系數合理，但兩個分配系數較接近導致分離因子不符合最優值。當以乙酸乙酯-正丁醇-水(1:3:4、1:4:4，V/V，含3%乙酸)為溶劑系統時，分配系數、分離因子及沉降時間均為最優值，有利于HSCCC的分離。

通過進一步的實際上機實驗可知，當以乙酸乙酯-正丁醇-水(含3%乙酸)為1:3:4(V/V)為溶劑系統時，HSCCC的固定相保留率為31%；而乙酸乙酯-正丁醇-水(含3%乙酸)為1:4:4(V/V)時，固定相保留率為46%。且由圖1可以看出，以乙酸乙酯-正丁醇-水(含3%乙酸)為1:4:4(V/V)為溶劑系統時，色譜圖的噪音值較低且分離度更好。綜上所述，本實驗選擇HSCCC溶劑系統為乙酸乙酯-正丁醇-水(含3%乙酸)，其比例為1:4:4(V/V)。

2.2 HSCCC條件優化

圖2 流動相不同流速和轉速條件HSCCC譜圖Fig.2 HSCCC profiles of teasaponin monomers obtained under different mobile phase flow rates and rotary speeds

確定了HSCCC溶劑系統的成分和比例后，對設備參數進行優化以使分離效果達到最好。影響HSCCC分離效果的因素主要有流動相流速、轉速及進樣量等，而柱溫對分離時間及分離度的影響均不顯著。通過選擇實驗，由圖2a、2b所示，當流速為1.8mL/min時，峰沒有完全分開，且轉速為800r/min時的固定相保留率為23%，而600r/min時為17%，表明低轉速會導致固定相的損失，降低固定相保留率，不利于目標物的分離。圖2c所示，當流速為1.5mL/min、轉速為800r/min時，兩個峰完全分開，固定相保留率為46%。通過反復實驗，得到HSCCC最佳操作條件：流動相流速1.5mL/min、固體轉速800r/min、進樣量100mg、進樣液3mL。

2.3 HSCCC分離結果

在上述優化的條件下，茶皂素經高速逆流分離得到2個較明顯的峰(圖1A)，分離時間為350min。分別收集這2個峰，進一步采用HPLC對其純度進行檢測。

2.4 分離物的鑒定

茶皂素對照品、粗品、HSCCC分離所收集的峰樣液以及茶皂素粗品加對照品的HPLC色譜圖見圖3。經HPLC檢測，在波長267nm條件下，通過和茶皂素對照品對照，粗品中有2個主要的峰，加入對照品后，2個峰的峰面積有所增加且出峰時間與對照品一致，而且起泡性很強，說明這兩個峰為茶皂素單體。

圖3 茶皂素HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of teasaponin standard, crude extract, crude extract with teasaponin standard from tea seed cake and two separated teasaponin monomers

根據面積歸一化法，粗品中2個單體的純度分別為37.4%、47.5%，經HSCCC分離后，單體1的純度為99.1%，單體2的純度為94.5%，取得了很好的分離效果。

對收集的峰樣液蒸去溶劑后干燥稱量，得茶皂素單體1的質量為11mg，單體2為15mg。

3 討 論

3.1 微波預處理能提高茶皂素得率

目前，茶皂素的提取方法很多。伍曉春等[3]通過有機溶劑浸提法提取茶皂素；曹萬新等[4]在0.1～0.14MPa的壓力使精濾后溶液進入膜設備來分離提取茶皂素。本研究采用微波輔助提取法，通過微波透射到生物組織內部，使物體內部分子產生振動和摩擦，對物體進行由內向外加熱。微波輔助提取只要幾分鐘，大大縮短了提取時間，提高了提取率。此方法今后也可用于其他植物提取物的提取工藝中。

3.2 HSCCC能高效快速地分離茶皂素

近年來，茶皂素單體不斷被分離純化出來。李靜等[12]用硅膠柱層析法使非極性雜質和茶皂素得到有效分離，經薄層檢測得到單一皂苷點；Lu等[13]通過葡聚糖凝膠柱及制備型HPLC從茶根中分離出3種茶皂素單體；Kobayashi等[14]用硅膠柱和反相HPLC從山茶樹葉的乙醇提取物里分離純化出3種新皂苷。目前大多采用柱層析的方法分離純化茶皂素，此法所需時間周期長，且固定相對樣品有不可逆吸附。本實驗中HSCCC只需350min即可分離茶皂素，操作簡單，所得單體純度高，實現了快速高效地分離茶皂素單體。

溶劑體系的選擇和優化是HSCCC中一項關鍵的步驟，文獻報道兩相溶劑系統的選定約占整個HSCCC工作量的90%以上[15]。目前，溶劑體系的選擇還沒有充分的理論依據，大多是參考已知溶劑體系或根據實驗經驗而進行。本實驗根據文獻和經驗，分別采用4種不同的溶劑系統，對目標化合物峰1、峰2的分配系數進行了比較分析。根據分析結果得知，采取乙酸乙酯-正丁醇-水(含3%乙酸)(1:4:4，V/V)體系可將2種茶皂素單體成功分開，并與其他雜質峰實現分離。實際上，目標化合物的極性差別是影響HSCCC色譜分離條件的一個重要因素。在已報道的相關文獻中，研究者們還可以通過改變HSCCC的色譜分離條件(流速或轉速)來提高色譜峰的分辨率，并獲得純度更高的目標化合物[16]。

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Isolation and Preparation of Teasaponin Monomers from Tea Seed Cake by High-Speed Counter-current Chromatography

CHEN Li，DENG Ze-yuan，HU Jiang-ning*，LI Jing，FAN Ya-wei，LIU Rong
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Objective: To develop a rapid and efficient method for preparing teasaponin monomers from tea seed cake using preparative high-speed counter-current chromatography (HSCCC). Methods: A crude extract rich in teasaponin monomers was obtained from tea seed cake by microwave-assisted extraction, and preliminarily purified by D-101 macroporous resin chromatography, followed by further HSCCC purification/fractionation with a binary phase system made up of ethyl acetate, n-butanol and 3% acetate (1:4:4, V/V) at a flow rate of 1.5 mL/min with rotation at 800 r/min under the conditions of 267 nm detection wavelength and 100 mg sample load. The final purification product was analyzed by HPLC. Results: Two teasaponin monomers with 99.1% and 94.5% purities were obtained after the HSCCC separation, and their dry weights were 11 mg and 15 mg, respectively. Conclusion: The proposed HSCCC method has the characteristics of simplicity, rapidity and high product purity, thereby providing a novel strategy for the separation of teasaponin monomers.

high-speed counter-current chromatography (HSCCC)；teasaponin monomers；preparation；purification

TS209

A

1002-6630(2010)20-0127-05

2010-06-27

2010年江西省重大科技專項

陳力(1987—)，女，碩士研究生，主要從事天然產物活性成分研究。E-mail：327477891@163.com

*通信作者：胡蔣寧(1981—)，男，講師，博士，主要從事天然產物活性成分研究。E-mail：hujiangning2005@hotmail.com