金針菇多糖-Fe(Ⅱ)螯合物的制備及抗氧化活性

馬利華，秦衛東，陳學紅，易劍文

(徐州工程學院食品學院，江蘇 徐州 221008)

金針菇多糖-Fe(Ⅱ)螯合物的制備及抗氧化活性

馬利華，秦衛東，陳學紅，易劍文

(徐州工程學院食品學院，江蘇 徐州 221008)

確定金針菇多糖與Fe(Ⅱ)的螯合工藝及其抗氧化活性。以螯合度為指標，探討螯合時間、金針菇多糖與Fe(Ⅱ)的質量比(mg/mg)、Fe(Ⅱ)的初始質量濃度(mg/mL)對金針菇多糖-Fe(Ⅱ)螯合物的影響，通過響應面試驗確定最佳螯合條件，并對金針菇螯合前后的抗氧化性進行比較。結果表明：當螯合時間6h、金針菇多糖與Fe(Ⅱ)的質量比3.54:1(mg/mg)、初始質量濃度為6mg/mL時螯合度為86.21%；各抗氧化性實驗結果顯示金針菇多糖螯合Fe(Ⅱ)后其抗氧化性能較螯合前有所提高。

金針菇多糖；螯合；Fe(Ⅱ)；抗氧化活性

多糖鐵配合物是目前臨床上應用的新型高效口服補鐵劑。研究表明，多糖鐵配合物以分子形式存在，結構類似胃鐵，能很容易地被小腸黏膜細胞吸收[1]。多糖鐵作為補鐵劑，不僅具有合適的配位穩定性，而且無游離鐵(Ⅱ)所致的胃腸黏膜刺激作用和由細胞膜脂質過氧化造成的細胞膜損傷，并且當其釋放鐵之后，多糖配體具有多方面的生物活性[2]。近年來，多糖鐵的研究非?；钴S，主要是利用傳統補血中藥，如當歸、地黃、百合、大棗、等提取的多糖進行化學合成獲得多糖鐵[3-6]。另外還有利用茶葉、紫菜等提取的具有免疫調節作用的多糖進行多糖鐵的制備[7-9]。

本實驗對金針菇多糖與Fe(Ⅱ)螯合物的制備工藝及其抗氧化性進行研究，使其螯合物既可以獲得多糖的功效，又可以達到補血的意義，為其在食品、醫藥、保健品及功能材料的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

金針菇 徐州市購。

三氯乙酸、正丁醇、三氯化鐵、蒽酮、鐵氰化鉀、2-硫代巴比妥酸、大豆卵磷脂(均為分析純)。

7230G型可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；DL-5低速大容量離心機 上海安亭科學儀器廠；THZ-C恒溫振蕩器 江蘇太倉市實驗設備廠；HJ-3數顯恒溫磁力攪拌器 常州國華電器有限公司；CW-2000超聲-微波協同萃取儀 上海市新拓微波溶樣測試技術有限公司；Senco R系列旋轉蒸發器 上海申生科技有限公司；TAS-990石墨爐原子吸收分光光度計 北京譜析儀器設備有限公司。

1.2 金針菇多糖的提取[8]

1.2.1 提取金針菇多糖的工藝流程

原料→烘干→提取→離心分離→去除雜蛋白→真空濃縮→醇析→離心分離→干燥→待用

1.2.2 多糖的測定[10]

采用蒽酮-硫酸比色法測定多糖提取率，得到回歸方程：y=0.7235x＋0.0042，相關系數R2=0.9981。

1.2.3 鐵離子標準曲線的制作[11]

取0.5、1、2、3、4mL鐵標準品定容于100mL容量瓶中得0.5、1、2、3、4μg/mL溶液，再分別取1mL定溶于100mL容量瓶中得0.005、0.01、0.02、0.03、0.04μg/mL溶液，在石墨爐中測其吸光度。得到回歸方程：y=0.0663x＋0.0549，相關系數R2=0.9997。

1.3 金針菇多糖與Fe(Ⅱ)螯合物的制備[12]

1.3.1 螯合率計算

取0.4g FeSO4·7H2O溶于100mL超純水中，配成Fe(Ⅱ)的質量濃度為2、3、4、5、6、7mg/mL的溶液，按金針菇多糖與Fe(Ⅱ)的質量比(mg/mg)為1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1加入多糖；30℃、150r/min離心，分別在2、4、6、8、1 0、1 2 h螯合，醇沉后，取上清液進行Fe(Ⅱ)的濃度測定，計算螯合率。

式中：C0為吸附前溶液中Fe(Ⅱ)的質量濃度(mg/mL)；C為吸附后溶液中Fe(Ⅱ)的質量濃度(mg/mL)。

1.3.2 響應面試驗設計[13]

根據采用Box-Behnken中心組合設計原理，選取金針菇多糖與Fe(Ⅱ)的螯合時間、金針菇多糖與Fe(Ⅱ)的質量比、Fe(Ⅱ)的初始質量濃度為金針菇多糖與Fe(Ⅱ)螯合的主要考察因素，以螯合率為考察指標，采用四因素三水平響應面試驗優選螯合工藝。試驗設計與分析采用Design-Expert軟件。

表1 Box-Behnken中心組合試驗因素水平表Table1 Factors and levels in the Box-Benhnken experimental design

1.4 金針菇多糖的抗氧化性能研究[14]

1.4.1 清除羥自由基(·OH)活性

用Fenton反應法產生·OH，H2O2/Fe2+體系可以通過Fenton反應產生·OH化學反應式如下：

以·O H氧化水楊酸產生有色物質，該產物在510nm處有強吸收峰，若體系中加入清除·OH的物質，則會減少有色物質生成，吸光度降低。吸光度越低，清除·O H效果越好。

取8支具塞試管，每支試管各加入9mmol/L FeSO41mL，9mmol/L水楊酸乙醇溶液2mL，按試管編號各加入不同質量濃度的多糖溶液2mL，最后加入8.8mol/L H2O22mL啟動反應，37℃反應0.5h。以蒸餾水作空白調零，在510nm波長處測定樣品的吸光度。

式中：A0為空白對照液的吸光度；Ax為加入提取液的吸光度。

1.4.2 清除DPPH自由基的活性

每個DPPH自由基分子在溶液中可生成一個穩定的含氮自由基，具有典型紫色。當它與提供1個電子的自由基清除劑作用時，生成無色產物，使溶液的典型紫色變淺。

稱取0.0128g DPPH自由基定容于50mL容量瓶中搖勻待測。取1mL DPPH自由基，加入3mL不同質量濃度的金針菇多糖螯合物溶液液，室溫暗光反應30min。以蒸餾水為參比，在517nm波長處測量吸光度。

表2 DPPH自由基實驗加樣表Table2 Reagent composition for DPPH free radical scavenging assay

樣品對DPP H自由基的清除能力(sc aveng ing activity，SA)可表示為下式：

1.4.3 對不飽和脂肪酸的抑制作用

卵磷脂C-2位上所含極低密度脂蛋白和低密度脂蛋白的過不飽和脂肪酸，在亞鐵離子的催化下，經振蕩能誘發脂質過氧化產生烷氧基(L O·)和烷基過氧基(LOO·)。在加熱的條件下，過氧化物可與硫代巴比妥酸(TBA)反應產生紅色化合物，并在532nm處有顯著的光吸收。

用pH7.4、0.1mol/L PBS配制1:25(g/mL)的卵磷脂懸濁液，取此懸濁液lmL，分別加入2mL不同質量濃度的樣品溶液、0.5mmol/L硫酸亞鐵溶液，用上述PBS補足至5mL，對照管除不加樣品溶液外其他試劑同前，并提前加入0.20g/mL TCA溶液0.5mL，對照管和樣品管37℃水浴15min，取出后加入20% TCA溶液0.5mL，靜置10min，3500r/min離心10min，取上清液2mL，分別加入0.8g/100mL硫代巴比妥酸1mL混勻，沸水浴15min，取出冷卻，在532nm波長處測吸光度。

式中：A0為對照管的吸光度；A1為樣品管的吸光度。

2 結果與分析

2.1 螯合時間對螯合效果的影響

取Fe(Ⅱ)質量濃度6mg/mL的溶液，按金針菇多糖與Fe(Ⅱ)的質量比為4:1加入多糖，30℃、150r/min，分別螯合反應2、4、6、8、10、12h，醇沉后，取上清液進行Fe(Ⅱ)的質量濃度測定，計算螯合率。

圖1 螯合時間對螯合效果的影響Fig.1 Effect of reaction time

圖1 表明，螯合率隨螯合時間而增加，但時間過長后會降低。在6h時達到最大值，過長時間可能由于螯合環結構變的不穩定而導致螯合率降低。

2.2 質量比對螯合效果的影響

取Fe(Ⅱ)質量濃度6mg/mL的溶液，按金針菇多糖與Fe(Ⅱ)的質量比(mg/mg)為1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1加入多糖，30℃、150r/min螯合反應6h，醇沉，取上清液進行Fe(Ⅱ)的質量濃度測定，計算螯合率。

圖2 金針菇多糖與Fe(Ⅱ)的質量比對螯合效果的影響Fig.2 Effect of mass ratio between reaction substrates

圖2 表明，螯合率隨金針菇多糖與Fe(Ⅱ)質量比的增加而增加，到4:1時達到最大值。質量比太低，不能形成穩定的環狀結構，螯合率低；質量比到達一定后繼續增加反而影響螯合反應的進行，螯合率下降。

2.3 Fe(Ⅱ)初始質量濃度對螯合效果的影響

取Fe(Ⅱ)質量濃度2、3、4、5、6、7mg/mL的溶液，按金針菇多糖與Fe(Ⅱ)的質量比(mg/mg)為4:1加入多糖，30℃、150r/min，螯合反應6h，醇沉，取上清液進行Fe(Ⅱ)的質量濃度測定，計算螯合率。

圖3 Fe (Ⅱ) 初始質量濃度對螯合效果的影響Fig.3 Effect of initial Fe(Ⅱ) concentration

圖3 表明，螯合率隨Fe(Ⅱ)的初始質量濃度的增加而增加，但質量濃度過高后反而降低，在6mg/mL時達到最大值。鐵的初始質量濃度過低導致與金針菇多糖反應的量過少形成的螯合物少而螯合率不高，當達到最大值時繼續增加鐵離子濃度會影響金針菇多糖與二價鐵的反應而螯合率下降。

2.4 采用響應面試驗設計優化金針菇多糖與Fe(Ⅱ)螯合物制備工藝

按照Box-Behnken試驗設計的統計學要求，對試驗進行回歸擬合，試驗設計及結果見表3。利用Design Expert軟件，通過對表3中的數據進行分析，得到二次多項回歸方程：

由表4方差分析結果可以看出，本實驗所選用的二次多項模型極顯著(P=0.0002＜0.001)，且方程失擬項不顯著(P=0.7331＞0.05)，說明各因素值與響應值之間的關系可以用此模型來函數化。相關系數R2=0.9623，表明螯合度的預測值與實際值之間具有較好的擬合度。其校正決定系數R2Adj=0.9246，表明只有約7.5%的螯合度的總變異不能用此模型來解釋。從3個因素對螯合度的影響來看，回歸方程的一次項X1、X2和X3對螯合度的線性效應極顯著(P=0.0004、0.0009、0.0001，均小于0.001)，且影響順序為X3＞X1＞X2；二次項X22對螯合度的曲面效應顯著(P=0.025＜0.05)，二次項X32對螯合度的曲面效應極顯著(P=0.0006＜0.001)，而X12對螯合度的曲面效應不顯著(P=0.2601＞0.05)；螯合時間/初始質量濃度(P=0.0267＜0.05)、金針菇多糖與Fe(Ⅱ)的質量比/初始質量濃度(P=0.0361＜0.05)的交互作用顯著，而螯合時間/金針菇多糖與Fe(Ⅱ)的質量比(P=0.2561＞0.05)的交互作用不顯著，其交互作用的響應曲面見圖4。

表3 Box-Behnken試驗設計與結果Table3 Box-Benhnken experimental design matrix and experimental results

表4 方差分析結果Table4 Variance analysis for the fitted regression model

圖4 兩因素交互作用對螯合率的影響Fig.4 Response surface and contour plots displaying the pairwise interactive effects of three reaction conditions on chelating degree

為求解最大值，解二次多項回歸方程可得，當螯合時間6h、金針菇多糖與Fe(Ⅱ)的質量比3.54:1、初始質量濃度6mg/mL時，螯合度達到理論最大值87.1972%。采用上述優化后的螯合條件對響應面發進行驗證，共進行3次重復實驗測得金針菇多糖與Fe(Ⅱ)螯合度平均為86.21%，相對標準偏差為1.15%，說明采用響應面法優化得到的螯合工藝條件參數準確可靠，按照建立的模型進行預測實際中是可行的。

2.5 金針菇多糖及其螯合物的抗氧化性能

2.5.1 清除·OH活性

圖5 金針菇多糖螯合前后對·OH的清除效果Fig.5 Concentration dependent hydroxyl free radical scavenging rates of Flammulina velutipes polysaccharide and its chelate with Fe(Ⅱ)

圖5 表明，無論螯合前與后，金針菇多糖均有一定的清除·OH的能力，且此能力在一定質量濃度范圍內呈一定的線性相關。通過計算半數清除率得到，螯合前IC50為0.84mg/mL，螯合后IC50為0.7mg/mL，抗氧化性提高了16.67%。

2.5.2 對DPPH自由基的清除效率

圖6表明，無論螯合前與后，金針菇多糖均有一定的清除DPPH自由基的能力，且此能力在一定質量濃度范圍內呈一定的線性相關。通過計算半數清除率得到，螯合前IC50為0.81mg/mL，螯合后IC50為0.62mg/mL，抗氧化性提高了23.46%。

圖6 金針菇多糖螯合前后對DPPH自由基的清除的效果Fig.6 Concentration dependent DPPH free radical scavenging rates of Flammulina velutipes polysaccharide and its chelate with Fe(Ⅱ)

2.5.3 對不飽和脂肪酸的抑制作用

圖7 金針菇多糖螯合前后對脂質過氧化物的清除效果Fig.7 Concentration dependent inhibition rates of Flammulina velutipes polysaccharide and its chelate with Fe(Ⅱ) against lecithin peroxidation

圖7 表明，無論螯合前與后，金針菇多糖對脂質過氧化物自由基均有一定的清除能力，且此能力在一定質量濃度范圍內呈一定的線性相關。通過計算半數清除率得到，螯合前IC50為0.87mg/mL，螯合后IC50為0.79 mg/mL，抗氧化性提高了9.20%。

2.5.4 螯合前后金針菇多糖IC50的對比

圖8 螯合前后IC50比較Fig.8 Comparison on pre- and post-chelating IC50values of Flammulina velutipes polysaccharide for scavenging free radicals and inhibiting lecithin peroxidation

通過對比螯合前后金針菇多糖對·OH、DPPH自由基、脂質過氧化物的半數清除率IC50，結果(圖8)表明，無論螯合前后，金針菇多糖清除DPPH自由基的能力力強于清除脂質過氧化物的能力和清除·OH能力，且清除·OH的能力略強于清除脂質過氧化物的能力；金針菇多糖與Fe(Ⅱ)螯合后，對·OH、DPPH自由基、脂質過氧化物清除能力分別比螯合前上升了16.67%、23.46%和9.20%。

3 結 論

采用響應面法優化金針菇多糖與Fe(Ⅱ)螯合物的制備工藝，結果顯示最佳螯合條件是當螯合時間為6h、金針菇多糖與Fe(Ⅱ)的質量比為3.54、初始質量濃度為6mg/mL時，螯合度為86.21%；DPPH自由基、·OH、脂質過氧化物自由基實驗顯示金針菇多糖螯合二價鐵后其抗氧化性能分別提高了16.67%、23.46%以及9.20%。

現代研究表明，在動物營養中起重要作用的微量元素均屬過渡金屬，其典型特征是能與－NH2、－OH等對正質子由強大吸引力的螯合劑形成穩定的螯合物[15]。本實驗表明，多糖是重要的生物大分子，表面絡合作用是其重要的特殊性質之一，可以利用此性質合成多糖鐵等有用的化合物。金針菇多糖經過與Fe(Ⅱ)離子的螯合，使分子內電荷趨于中性，穩定常數比較適中，使金屬易于釋放出來，具有一定的還原性。同時螯合物的配位體-金針菇多糖也具有抗氧化性，從而提高了金針菇多糖Fe(Ⅱ)螯合物的抗氧化能力。

通過本實驗的研究，為金針菇多糖Fe(Ⅱ)螯合物的進一步開發利用提供科學依據，金針菇多糖Fe(Ⅱ)螯合物有望成為營養型補鐵劑。

[1]趙兵, 徐海清. 枸杞多糖鐵(Ⅲ)配合物的合成及理化性質的初步研究[J]. 中成藥, 2008, 30(8): 1245-1246.

[2]陳國慶, 先宏. 植物多糖類鐵復合物的研究進展[J]. 重慶中草藥研究, 2009, 60(2): 35-38.

[3]張玉, 戴立泉, 王凱平. 正交試驗優化當歸多糖鐵的合成條件研究[J]. 中成藥, 2007, 29(4): 581-583.

[4]裴曉紅, 李玉賢, 李娟. 地黃多糖鐵(Ⅲ)配合物的合成及一般性質研究[J]. 河南科學, 2005, 23(4): 499-501.

[5]李玉賢, 楊林莎. 百合多糖Fe(Ⅲ)配合物的制備及其理化性質[J]. 華西藥學雜志, 2006, 21(6): 537-539.

[6]李玉賢, 裴曉紅. 大棗多糖鐵(Ⅲ)配合物的合成及一般性質研究[J].中成藥, 2006, 28(5): 707-709.

[7]李玉賢, 裴曉紅. 茶葉多糖鐵配合物的合成及一般性質研究[J]. 食品研究與開發, 2005, 26(5): 26-29.

[8]陳國慶, 先宏, 叢建波, 等. 褐藻多糖鐵對環磷酰胺致貧血小鼠的保護作用[J]. 解放軍藥學學報, 2009, 25(2): 155-158.

[9]盛小莉. 多糖鐵復合物影響的研究[D]. 武漢: 華中科技大學, 2008: 54-59.

[10]陳留勇, 孟薛軍, 孔丘蓮, 等. 黃桃水溶性多糖的提取和分離純化[J].食品科學, 2004, 25(1): 81-84.

[11]趙惠敏, 閆俊英. 氨基乙酸螯合鐵的研究[J]. 河北師范大學學報: 自然科學版, 2000, 24(2): 232-233.

[12]李公斌, 王振宇. 黑木耳多糖與Fe(Ⅱ)螯合物的制備工藝及紅外光譜的研究[J]. 食品工業科技, 2006(5): 136-138.

[13]王明艷, 楊凡, 李燕, 等. 響應面發優化百部多糖提取條件研究[J].食品科學, 2009, 30(6): 80-83.

[14]馬利華, 賀菊萍, 秦衛東, 等. 洋槐花提取物抗氧化性能研究[J]. 食品科學, 2007, 28(9): 75-77.

[15]黃澤元, 王海濱. 食品營養強化劑蛋氨酸亞鐵螯合物合成工藝研究[J]. 中國糧油學報, 1999, 14(4): 25-27.

Preparation and Antioxidant Activity Evaluation of Flammulina velutipes Polysaccharide/Fe(Ⅱ) Chelate

MA Li-hua，QIN Wei-dong，CHEN Xue-hong，YI Jian-wen (College of Food Engineering, Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou 221008, China)

In this study, the optimal conditions for the chelating reaction between Flammulina velutipes polysaccharide and Fe(Ⅱ) for achieving maximum chelating degree were investigated using single-factor method and response surface analysis, and evaluation of antioxidant activity of the obtained Flammulina velutipes polysaccharide/Fe(Ⅱ) chelate was performed. A maximum chelating degree of 86.21% was achieved when the reaction between Fe(Ⅱ) with an initial concentration of 6 mg/mL and Flammulina velutipes polysaccharide (3.54:1, mg/mg) was allowed to proceed for 6 h. Moreover, the antioxidant activity evaluation indicated that the abilities of Flammulina velutipes polysaccharide to scavenge hydroxyl and DPPH free radicals and the inhibitory effect against lecithin peroxidation were all improved after the chelation with Fe(Ⅱ).

Flammulina velutipes polysaccharide；chelation；Fe(Ⅱ)；antioxidant activity

S646.15；TS201.2

A

1002-6630(2010)20-0202-06

2010-06-21

馬利華(1966—)，女，副教授，碩士，研究方向為天然產物與食品加工。E-mail：mlh6610@163.com