藍莓色素的超聲提取工藝及穩(wěn)定性

楊雪飛，潘利華，羅建平*

(合肥工業(yè)大學生物與食品工程學院，安徽 合肥 230009)

藍莓色素的超聲提取工藝及穩(wěn)定性

楊雪飛，潘利華，羅建平*

(合肥工業(yè)大學生物與食品工程學院，安徽 合肥 230009)

在單因素試驗基礎上，采用中心組合設計方法優(yōu)化藍莓色素的超聲提取工藝，并分析色素的穩(wěn)定性。結果表明：藍莓色素超聲提取工藝的最佳條件為乙醇體積分數(shù)45%、料液比(g/mL)1:13、超聲溫度55℃、pH4.5、超聲功率450W、超聲時間50min。在此條件下，藍莓色素提取率為274.36U/g。藍莓色素耐熱，在K+、Na+、Mg2+等金屬離子以及山梨酸鉀等食品添加劑條件下穩(wěn)定性較高，而在Zn2+、Fe2+、Fe3+、Ca2+及堿性環(huán)境條件下不穩(wěn)定。

藍莓；超聲提取；天然色素；穩(wěn)定性；中心組合設計

藍莓為杜鵑花科(Ericaceae)越桔屬(Vaccinium spp.)多年生落葉或常綠灌木果樹，其果實為漿果，近圓形，呈藍色，是少有的藍色食物之一。藍莓果果肉細膩，甜酸可口，不僅含有VA等營養(yǎng)物質，而且富含天然藍色素[1-2]。研究表明，藍莓藍色素的主要成分為花青素(anthocyanins)[3]，是一種強有力的抗氧化劑，具有保護人體免受自由基損傷，增強免疫力等功效，對眼科疾病和心腦血管疾病也有較好的療效[4-6]，因此可作為一種天然色素資源應用于食品、制藥和化妝品等行業(yè)。

提取花青素的常規(guī)方法為乙醇浸提。但乙醇浸提法存在耗時長、效率低的缺陷，并且長時間的浸提易導致花青素降解而降低其抗氧化活性[7]。超聲提取法通過超聲波空化等效應加速物質的溶出，具有提取周期短、效率高的優(yōu)勢，受到廣泛關注[8-9]。中心組合設計(central composite design，CCD)是一種基于統(tǒng)計技術的優(yōu)化方法，具有實驗次數(shù)少、精度高、預測性好等優(yōu)點，已成功應用于化工、生物等許多領域[10]。本研究在單因素試驗的基礎上，篩選出影響藍莓色素提取率的關鍵提取工藝，再通過中心組合設計試驗優(yōu)化超聲提取工藝參數(shù)，最后分析測定超聲提取產物藍莓色素的穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍莓凍果 安徽徽王食品有限公司；D101大孔樹脂 天津波鴻樹脂科技有限公司。

1.2 儀器與設備

UV-1600分光光度計 北京瑞利分析儀器公司；旋轉蒸發(fā)器 上海申勝生物技術有限公司；SY-1000E多用途恒溫超聲提取器 北京弘祥隆生物技術開發(fā)有限公司；SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水真空泵 鞏義市英峪予華儀器廠。

1.3 藍莓色素提取工藝流程

藍莓冷凍鮮果→清洗→搗碎→超聲提取→抽濾→離心(4000r/min，15min)→清液→蒸發(fā)濃縮→過D101大孔樹脂→乙醇洗脫→洗脫液→旋轉蒸發(fā)除去乙醇→冷凍干燥→藍莓色素

1.4 藍莓色素超聲提取條件的優(yōu)化

1.4.1 單因素試驗條件

稱取清洗干凈的藍莓冷凍鮮果40.0g用植物組織搗碎機搗碎，轉入超聲波提取器中，按一定比例加入不同體積分數(shù)的乙醇提取劑，在設定超聲溫度和超聲功率條件下超聲提取一定時間后，取出抽濾，取濾液離心，收集上清液，測定上清液中藍莓色素的含量。研究不同乙醇體積分數(shù)、料液比、超聲溫度、p H值、超聲功率、超聲時間對藍莓色素提取率的影響。

1.4.2 中心組合試驗條件

根據(jù)單因素試驗結果選取適當條件范圍進行中心組合設計(表1)優(yōu)化藍莓色素超聲提取工藝參數(shù)。

表1 中心組合試驗因素水平編碼表Table1 Factors and levels in the central composite design

1.5 藍莓色素的穩(wěn)定性研究

用于穩(wěn)定性研究的藍莓色素均來自于優(yōu)化后的超聲提取條件下的提取物，經D101大孔樹脂用乙醇洗脫后凍干獲得的產物。

1.5.1 pH值對藍莓色素穩(wěn)定性的影響

藍莓色素溶液的pH值對其色澤有較大影響。隨著溶液pH值的增高(堿性增強)，色素水溶液由藍紫色(酸性環(huán)境)轉變?yōu)樽霞t色(中性環(huán)境)后褪色為淺黃色(堿性環(huán)境)，最大吸收波長亦發(fā)生變化，藍紫色、紫紅色、淺黃色藍莓色素溶液最大吸收峰分別為520、490nm和380nm。本研究考察藍紫色藍莓色素溶液的性質，所以均以520nm處的吸光度表征。

用雙蒸水配制0.03mg/mL藍莓色素溶液，分別取50mL置于不同的錐形瓶中，用HCl溶液或NaOH溶液調節(jié)其pH值分別為pH3.0、5.0、7.0、9.0，放置室內暗處25℃保存，定時取樣測定520nm處的吸光度。

1.5.2 溫度對藍莓色素穩(wěn)定性的影響

用雙蒸水配制0.03mg/mL藍莓色素溶液，分別取5 0 mL置于不同的錐形瓶中，將錐形瓶分別置于4、25、85℃的避光環(huán)境中保存，定時取樣測定520nm處的吸光度。

1.5.3 食品添加劑對藍莓色素穩(wěn)定性的影響

用雙蒸水配制0.03mg/mL藍莓色素溶液，分別取50mL置于不同的錐形瓶中，再向錐形瓶分別加入質量分數(shù)1%葡萄糖、1%蔗糖、0.1%山梨酸鉀、0.1%苯甲酸鈉和0.1%抗壞血酸，放置室內暗處25℃保存，定時取樣測定520nm處的吸光度。

1.5.4 金屬離子對藍莓色素穩(wěn)定性的影響

用雙蒸水配制0.03mg/mL藍莓色素溶液，分別取50mL置于不同的錐形瓶中，再向錐形瓶分別加入終濃度為0.1mol/L的KCl、MgCl2、ZnCl2、NaCl、FeCl2、FeCl3、CaCl2，放置室內暗處25℃保存，定時取樣測定520nm處的吸光度。

1.6 藍莓色素的色價測定

[11]的方法，取經超聲提取離心獲得的部分上清液放入1cm比色皿中，使其吸光度在0.2～0.7范圍內，并測定其最大吸收波長520nm下的吸光度。以色價的大小表征藍莓色素提取率的高低。

色價/(U/g)= A520nm×稀釋倍數(shù)×10/m式中：m為藍莓干質量。

2 結果與分析

2.1 藍莓色素超聲提取的單因素分析

2.1.1 乙醇體積分數(shù)對藍莓色素提取率的影響

圖1 乙醇體積分數(shù)對提取率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on extraction rate of blueberry pigments

由圖1可知，在料液比1:10、超聲溫度50℃、pH自然、超聲功率400W、超聲時間60min條件下，乙醇體積分數(shù)為25%～65%時，藍色色素提取率沒有顯著差別(P＞0.05)；乙醇體積分數(shù)為45%時提取率達最大值183.95U/g；乙醇體積分數(shù)大于45%時，提取率隨乙醇體積分數(shù)的增加略有下降。由于藍色色素是一類極性較大的花青素物質，易溶于水、乙醇、稀酸等極性溶劑中[12]，在45%乙醇溶液中，醇溶性和水溶性的花青素類物質都能最大程度的溶出，而當乙醇體積分數(shù)超過45%時，水溶性花青素溶出量減少，因此藍色色素得率減少。故選擇乙醇體積分數(shù)為45%。

2.1.2 料液比對藍莓色素提取率的影響

圖2 料液比對提取率的影響Fig.2 Effect of material/liquid ratio on extraction rate of blueberry pigments

由圖2可以看出，在超聲溫度50℃，pH自然、超聲功率400W、超聲時間60min條件下，當液料比在5～15mL/g時，提取率隨液料比的增大而增長較快，當液料比大于15mL/g時，提取率有所下降，可能是因為單位體積提取劑中對藍莓色素的溶解量基本飽和，藍莓色素向提取劑的擴散達到了平衡所致。

2.1.3 超聲溫度對藍莓色素提取率的影響

圖3 超聲溫度對提取率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction rate of blueberry pigments

從圖3可以看出，在料液比1:10、pH自然、超聲功率400W、超聲時間60min條件下，當提取溫度低于50℃時，隨溫度升高藍莓色素提取率呈上升趨勢，在50℃時，提取率達到最大值；隨著溫度的繼續(xù)升高，藍莓色素提取率開始下降。這可能是由于在升溫和機械波作用下，藍莓色素結構遭到破壞，造成了提取率下降。因此，最佳提取溫度應在50℃附近，選取50℃為自變量超聲溫度的零水平。

2.1.4 提取劑pH值對藍莓色素提取率的影響

圖4結果表明，在料液比1:10、超聲溫度50℃、超聲功率400W、超聲時間60min條件下，pH值對藍莓色素提取率有顯著影響(P＜0.05)，提取率隨pH值的升高而降低。這與藍莓色素結構有關，其結構中含有酚羥基，呈酸性；而因其結構中吡喃雜環(huán)上的氧原子的親電子性，使其具有堿性；兩性特征使其色調及穩(wěn)定性受pH值變化的影響較大[13]。

圖4 pH值對提取率的影響Fig.4 Effect of pH on extraction rate of blueberry pigments

2.1.5 超聲功率對藍莓色素提取率的影響

圖5 超聲功率對提取率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic power on extraction rate of blueberry pigments

由圖5可知，在料液比1:10、超聲溫度50℃、pH自然、超聲時間60 min條件下，當超聲功率小于500W時，藍莓色素提取率隨超聲功率的升高而升高，當超聲功率大于500W時，提取率隨超聲功率的升高而增加不明顯，當超聲功率高于700W時，藍莓色素提取率有所下降。超聲波作用的效果取決于單位面積輸出的超聲功率和提取物的結構和性質，不同的提取物有著不同的適宜提取的超聲功率范圍，超過此范圍，超聲作用可能會使目標產物發(fā)生降解而影響其得率[14]。

2.1.6 超聲時間對藍莓色素提取率的影響

圖6結果顯示，在料液比1:10、超聲溫度50℃、pH自然、超聲功率400W條件下，隨著超聲時間的延長，藍莓色素提取率呈先快速增加后緩慢上升的趨勢。根據(jù)Fick擴散定律，在一定條件下，超聲時間越長，擴散的物質越多，提取率越高，即提取率與提取時間成正比；但時間過長，擴散系數(shù)降低，提取率不再與時間成正比，而且會延長操作周期、增加能耗。

圖6 超聲時間對提取率的影響Fig.6 Effect of extraction duration on extraction rate of blueberry pigments

2.2 中心組合設計試驗優(yōu)化藍莓色素的超聲提取工藝

利用Design-Expert 7.1軟件，采用響應面法對表2中藍莓色素提取率試驗數(shù)據(jù)進行分析，得到提取率對料液比(A)、超聲溫度(B)、pH值(C)、超聲功率(D)、超聲時間(E)的二次多項回歸模型為：

Y =150.43－10.65A+10.52B+3.06C+2.32D－5.86E+ 9.66AB－20.61AC－3.33AD－4.51AE－18.14BC+4.66BD+ 9.95BE－17.10CD+7.13CE+22.27DE+7.03A2+7.57B2+ 21.64C2－0.86D2+16.73E2

對該模型進行顯著性檢驗，結果見表3。由表3可知，模型的F=34.68，P＜0.0001＜0.01，說明所選用的二次多項模型具有高度的顯著性，失擬項F=1.03，在P＜0.05水平上不顯著(P=0.6118＞0.05)，其校正決定系數(shù)R2Adj為0.9729，表明此模型擬合度好，試驗誤差小，說明可以用此模型來分析和預測藍莓色素的超聲提取工藝結果。

根據(jù)回歸方程得A、B、C、D、E優(yōu)水平均為+1水平，即最佳工藝條件為料液比1:13、超聲溫度55℃、pH4.5、超聲功率450W、超聲時間50min。對優(yōu)化提取條件進行驗證，得實際藍莓色素提取率為274.36U/g，與預測值相對誤差為2.57%。

表3 回歸模型方差分析Table3 Variance analysis for the fitted regression model

2.3 藍莓色素的穩(wěn)定性分析

表4顯示，藍莓色素溶液為pH9.0時，貯藏期間吸光度逐漸減少；pH5.0和pH7.0條件下，藍莓色素溶液的吸光度變化不大；而在pH3.0溶液下，藍莓色素溶液的吸光度稍有增加。同時觀察發(fā)現(xiàn)，pH3.0和pH5.0的色素溶液呈藍紫色，pH7.0的色素溶液呈紫紅色，pH9.0的色素溶液呈淺黃色。由此可見，藍莓藍紫色色素不適于在堿性環(huán)境中保存和著色。

表2 中心組合試驗設計與結果Table2 Central composite design arrangement and experimental results

表4 p H值、溫度、食品添加劑和金屬離子對藍莓色素吸光度的影響Table4 Effects of pH, temperature, additives and metal ions on the stability of blueberry pigments

將藍莓色素溶液分別貯藏于4、85℃時，其吸光度變化差異不顯著(P＞0.05)，說明藍莓色素在低溫和高溫條件下穩(wěn)定性較高；但貯藏于25℃時，其吸光度隨著貯藏時間的延長而增大，這可能與該溫度有利于花青素的聚合有關[12]。

從表4可以看出，藍莓色素于25℃貯藏時，葡萄糖、防腐劑苯甲酸鈉和山梨酸鉀對其色澤沒有顯著影響；加入抗壞血酸后，吸光度增大，對該色素起穩(wěn)定作用；而與甜味劑蔗糖共存時，隨著放置時間的延長,色素溶液的吸光度亦增大。說明藍莓色素對被試食品添加劑有較好的穩(wěn)定性。

實驗過程中發(fā)現(xiàn)，藍莓色素溶液中加入ZnCl2后變?yōu)榈揖G色，加入FeCl2后變?yōu)樯罨揖G色，加入FeCl3后變?yōu)樯铧S褐色，加入CaCl2后變?yōu)辄S褐色，且均出現(xiàn)沉淀，可能是因為這些金屬離子與藍莓色素發(fā)生了絡合反應所致。K+、Na+和Mg2+對藍莓色素溶液吸光度沒有顯著影響(表4)。

3 結 論

藍莓色素超聲提取工藝的最佳條件為乙醇體積分數(shù)45%、料液比1:13、超聲溫度55℃、pH4.5、超聲功率450W、超聲時間50min。此條件下藍莓色素提取率為274.36U/g。與預測值的相對誤差為2.57%。

藍莓色素顏色變化和穩(wěn)定性受熱、K+、Na+、Mg2+及山梨酸鉀等食品添加劑的影響較小，而在Z n2+、Fe2+、Fe3+、Ca2+及堿性環(huán)境條件下不穩(wěn)定。

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Ultrasonic-aided Extraction and Stability Assessment of Blueberry Pigments

YANG Xue-fei，PAN Li-hua，LUO Jian-ping*
(School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

The ultrasonic-aided extraction of blueberry pigments was optimized by single-factor and central composite design methods. Besides, the stability of blueberry pigments under different environmental conditions was also measured. The optimal conditions for the extraction of blueberry pigments were found to be: extraction solvent, 45% alcohol; ultrasonic power, 450 W; material/liquid ratio, 1:13, extraction temperature, 55 ℃, extraction duration, 50 min; and pH 4.5. The extraction rate of blueberry pigments was 3.26% under these optimal conditions. Blueberry pigments were thermostable. The stability of blueberry pigments was good in the respective presence of K+, Na+and Mg2+and potassium sorbate, while Zn2+, Fe2+, Fe3+, Ca2+and alkaline condition could damage their stability.

blueberry；ultrasonic-aided extraction；natural pigment；stability；central composite design

TS202.3

A

1002-6630(2010)20-0251-05

2010-06-30

合肥工業(yè)大學博士專項(2010HGBZ0296)

楊雪飛(1973—)，女，工程師，碩士，研究方向為食品生物化學。E-mail：yangxuefei2000@126.com

*通信作者：羅建平(1966—)，男，教授，博士，研究方向為中草藥與功能食品化學。E-mail：jianpingluo@yahoo.com.cn