高效毛細管電泳法在黃酮類化合物分析檢測中的應用

周一鳴，周小理,*，崔琳琳

(1.上海應用技術學院香料香精技術與工程學院，上海 200235；2.上海商學院食品工程系，上海 200235)

高效毛細管電泳法在黃酮類化合物分析檢測中的應用

周一鳴1，周小理1,*，崔琳琳2

(1.上海應用技術學院香料香精技術與工程學院，上海 200235；2.上海商學院食品工程系，上海 200235)

建立一種高效毛細管電泳(HPCE)法測定黃酮類化合物含量的方法。電解質溶液以20mmol/L硼砂-硼酸溶液(pH8.4)作為緩沖液，在25℃、20kV壓力條件下進行電泳，245nm波長處檢測，線性關系良好，在10min內黃酮類化合物完全分離，符合定性研究和定量測定的要求。該方法具有較好的分離效果和良好的精密度，可應用于黃酮類化合物的測定。

黃酮類化合物；高效毛細管電泳

高效毛細管電泳(high performance capillary electrophoresis，HPCE) 是一類以毛細管為分離通道、以高壓直流電場為主要驅動力的液相分離技術。相比傳統電泳和高效液相色譜(HPLC)，它具有高效、快速、高靈敏度、高度自動化等特點，并且所需樣品量和溶劑消耗少、運行成本低、對環境污染小[1]。在一臺HPCE儀器上可兼容多種分離模式，因此適用樣品范圍廣，已被廣泛應用于生物、化學、醫藥、食品、環保等領域[2-5]。

蘆丁和槲皮素作為兩種重要的黃酮類化合物，在植物中大量存在，目前對其分析測定方法有高效液相色譜法、熒光光譜法、化學發光法等[6]。但采用高效毛細管電泳法[7-15]同時檢測此兩種物質未見有報道。本實驗以蕎麥芽粉為對象，采用高效毛細管電泳法一次同時分離測定出其中蘆丁和槲皮素的含量，效果良好，可為今后測定植物樣品中黃酮類化合物(含黃酮類化合物的營養食品)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

蕎麥 市購。

蘆丁(Rutin)、槲皮素(Quercetin)對照品 Sigma公司；其他試劑均為分析純；水為二次重蒸水。

CL3030型高效毛細管電泳儀 北京彩陸科學儀器有限公司；未涂層彈性石英毛細管柱(50cm×50cm，75μm，有效長度40cm) 河北永年光導纖維廠；電子天平、pH計 Metiler Toledo公司；超聲波清洗器 昆山超聲波有限公司。

1.2 方法

1.2.1 對照品溶液的制備

精密稱取蘆丁10.8mg、槲皮素9.9mg，分別用甲醇溶解并定容至10mL，得到蘆丁標準液的質量濃度為1.08mg/mL，槲皮素標準液的質量濃度為0.99mg/mL。精密稱取桑色素7.8mg，用甲醇定容至25mL，得到桑色素標準液的質量濃度為0.312mg/mL。

1.2.2 樣品溶液制備

蕎麥芽經冷凍干燥后粉碎，在60℃條件下干燥至質量恒定。精密稱取蕎麥芽粉樣品1.0g，放入三角瓶中，加入甲醇20mL，稱量。超聲提取40min，擦凈瓶外壁水，冷卻至室溫后稱量，用甲醇補足質量損失。過濾，取濾液，3000r/min離心3min后進行HPCE檢測。

1.2.3 電泳條件

該條件為根據預實驗確定的最佳條件。以20mmol/L硼砂-硼酸溶液(pH8.4)為電泳緩沖液，未涂層彈性石英毛細管，20kV恒壓條件下電泳分離，245nm處檢測。所有溶液使用前使用0.45μm濾膜過濾，每次運行后依次以0.10mol/L NaOH溶液、超純水和電泳緩沖液分別沖洗5min。所有實驗均在室溫條件下進行。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的建立

精密稱取蘆丁標準品10.8mg、槲皮素標準品9.9mg，分別用甲醇溶解并定容至10mL，得到蘆丁標準液的質量濃度為1.08mg/mL，槲皮素標準液的質量濃度為0.99mg/mL。分別取0.1、0.5、1.0、2.0、5.0mL的標準溶液，定容到10mL，得到6個質量濃度水平。以峰面積為縱坐標(y)、標準品含量為橫坐標(x)建立標準曲線。

表1 標準曲線回歸方程、線性范圍和最低檢測限和定量限Table1 Figures of merit of standard curves as well as limits of detection and quantification of rutin and quercetin

由表1可知，本方法對照品溶液吸取量在0.1～5.0mL之間時，測試結果與被測物質質量濃呈良好線性關系，因此，本方法可作為蕎麥芽粉蘆丁和槲皮素含量的測定方法。圖1表明該方法有良好的檢出效果。

圖1 混標(A)和蕎麥(B)的HPEC圖譜Fig.1 HPEC chromatograms of mixed rutin and quercetin standards and flavonoid compounds extracted from buckwheat sprouts

2.2 穩定性實驗

取制備好的蕎麥芽粉提取液樣品，于0、12、24、36、48、72h分別進樣，重復6次，記錄蘆丁和槲皮素的峰面積，根據標準曲線計算蘆丁、槲皮素含量分別為6.40mg/g和5.19mg/g，相對標準偏差分別1.9%和1.5%。

2.3 精密度實驗

取制備好的蕎麥芽粉提取液樣品，重復進樣6次，記錄蘆丁和槲皮素的峰面積，根據標準曲線計算蘆丁、槲皮素含量分別為6.58mg/g和5.47mg/g，相對標準偏差分別為1.7%和2.1%。可知用HPCE法測定蕎麥芽中黃酮化合物含量，結果變異系數較小，說明該方法的重現性準確性良好，且測定條件易控制，測定結果較滿意。

2.4 重復性實驗

取同一批的蕎麥芽粉提取液樣品，重復進樣5次，記錄蘆丁和槲皮素的峰面積，根據標準曲線計算蘆丁、槲皮素含量分別為6.76mg/g和5.28mg/g，相對標準偏差分別為2.3%和2.0%。

2.5 加樣回收率實驗

表2 蕎麥芽中黃酮化合物含量測定的回收率實驗Table2 Spike recoveries of the method for rutin and quercetin

采用加樣回收率法，精密稱取1.0g蕎麥芽粉，加入蘆丁和槲皮素標準溶液各5mL，用1.2.2節方法進行提取檢測，記錄蘆丁和槲皮素的峰面積，計算回收率及相對標準偏差，回收率實驗結果如表2所示。平均回收率分別為91.9%和96.0%，RSD為2.1%和2.8%，測定的結果與真實值接近的程度較好，準確度較高。因此以蘆丁、槲皮素為對照品，利用HPCE法測定蕎麥芽粉中黃酮化合物含量符合微量成分分析要求，具有較好的應用價值。

3 結 論

本實驗建立測定蕎麥芽粉中蘆丁、槲皮素黃酮類化合物含量的高效毛細管電泳法，經過方法學驗證得知，本法線性關系良好、重現性好、穩定性可靠、回收率高，方法簡單可靠，為實現快速、準確測定植物樣品中黃酮類化合物含量提供了一種新的方法。

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Application of High Performance Capillary Electrophoresis to the Determination of Flavonoid Compounds

ZHOU Yi-ming1，ZHOU Xiao-li1,*，CUI Lin-lin2
(1. School of Perfume and Aroma Technology, Shanghai Institute of Technology, Shanghai 200235, China；2. College of Food Science, Shanghai Business School, Shanghai 200235, China)

A method was developed for the determination of flavonoid compounds using high performance capillary electrophoresis (HPCE). The electrolyte buffer used was 20 mmol/L borax/boracic acid solution (pH 8.4). Electrophoresis was performed at 25 ℃ and 20 kV voltage. The detection wavelength was set as 245 nm. The developed method displayed good linearity. A thorough chromatographic separation of flavonoid compounds was achieved within 10 min, which meets the requirements for qualification and quantification. This method giving good separation and having high precision is applicable for the determination of flavonoid compounds in practice.

flavonoids；high performance capillary electrophoresis (HPCE)

TS207.3

A

1002-6630(2010)20-0275-03

2009-11-26

國家自然科學基金項目(31071527)；上海市優秀青年基金項目(yyy09013)；上海市科委重點科技攻關項目(074905114)；“十一五”國家科技支撐計劃項目子課題(2006BAD02B06/18)

周一鳴(1981—)，男，助教，碩士，研究方向為天然產物開發與利用。E-mail：zhouym@sit.edu.cn

*通信作者：周小理(1957—)，女，教授，研究方向為食品新資源深度開發與利用。E-mail：zhouxl@sit.edu.cn