乳酸菌發酵酸豆乳香氣成分分析及評價

張 佳，馬永昆,,*，崔鳳杰，陳 凡，孫樂六，夏 蓉

(1.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇 鎮江 212013；2.江蘇省農產品生物加工與分離工程技術研究中心，江蘇 鎮江 212004)

乳酸菌發酵酸豆乳香氣成分分析及評價

張 佳1，馬永昆1,2,*，崔鳳杰1，陳 凡1，孫樂六2，夏 蓉2

(1.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇 鎮江 212013；2.江蘇省農產品生物加工與分離工程技術研究中心，江蘇 鎮江 212004)

采用頂空固相微萃取(SPME)與氣相色譜-質譜(GC-MS)聯用檢測分析技術，并結合感官評分法對保加利亞乳桿菌、瑞士乳桿菌和嗜熱鏈球菌3種乳酸菌混合發酵的豆乳進行香氣分析和評價，探討不同乳酸桿菌及其與嗜熱鏈球菌按比例混合發酵對酸豆乳香氣的影響。感官評定結果表明，乳酸菌種及其混合比例對發酵酸豆乳的香氣有明顯影響。香氣檢測分析發現，對比發酵前樣品，發酵后酸豆乳中酮類、酸類含量顯著增加，而醛類和醇類含量明顯減少，3種酸豆乳中相同關鍵香氣成分含量有差異。感官評定與香氣檢測分析結果一致，1:1的保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌組成的菌種產香濃郁，產酸力高，是豆乳發酵的優選菌種。

乳酸菌；酸豆乳；固相微萃取(SPME)；氣相色譜-質譜法(GC-MS)；香氣

大豆(Glycine max(L.) Merr.)為蝶形花科大豆屬一年生草本植物種子，富含蛋白質、不飽和脂肪酸、維生素、黃酮等成分，具有輔助降血脂、抑制腫瘤和阻止動脈硬化等作用[1]。乳酸菌發酵的酸豆乳可保留大豆的營養功能成分，賦予豆乳特有的乳酸發酵清香、醇香和酯香等，乳酸菌發酵產生的多種蛋白水解酶可使大豆蛋白水解為小分子肽和氨基酸，有利于人體的消化吸收[2]。國內酸豆乳的研究已有十余年時間，但還沒有投入工業化生產，主要原因是缺少適合酸豆乳生產的專用菌種，導致其風味存在明顯的缺陷[3]。

豆乳乳酸菌發酵可產生乳酸、檸檬酸和乙酸等有機酸，并將檸檬酸代謝過程中產生的α-乙酰乳酸轉變成具有發酵豆乳制品特征香氣的丁二酮。同時乳酸菌發酵過程中生成的小分子肽和氨基酸，不僅具有一定的生物活性，還會發生進一步脫氨反應，生成酮、醛、醇和酸等成分，形成特有的酸豆乳發酵香[4-5]。本研究從已收集的乳酸菌中篩選出適合豆乳發酵的菌種，利用頂空固相微萃取(SPME)富集、氣相色譜-質譜(GC-MS)聯用分析檢測發酵豆乳的主要香氣成分，并結合感官評定，較全面地分析評價了酸豆乳發酵香氣成分，為篩選確定適合高質量豆乳發酵的乳酸菌提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆 產地山東；純牛奶 蒙牛乳業股份有限公司。保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus) 江蘇大學超高壓食品技術研究所保藏；瑞士乳桿菌(L a c t o b a c i l l u s helveticus) 丹尼斯克(中國)有限公司；氫氧化鈉(分析純) 上海化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

雙極性50μm聚二甲基硅氧烷PDMS萃取纖維頭 美國Supelco公司；HP6890/5973氣相色譜-質譜聯用儀 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 酸豆乳制作工藝流程

大豆→去雜→浸泡→熱燙→磨漿→膠磨→過濾→加入牛奶得豆乳(豆漿:牛奶體積比為8:2)，然后加入糖(4g/ 100mL 豆乳)→均質→灌裝→殺菌→冷卻→接種(體積分數4%接種量)→發酵→冷藏后熟→檢測

在前期工作的基礎上，將篩選的單菌種進行不同方式的組合，并接種發酵。LBS1代表由L.bulgaricus和S.thermophilus按照體積比1:1混合發酵所得的酸豆乳，LHS代表由L. helveticus和S.thermophilus按照1:1混合發酵所得的酸豆乳，LBS2代表由L.bulgaricus和S.thermophilus按照2:1混合發酵所得的酸豆乳。

1.3.2 酸度測定方法

依照GB/T 5409—85《牛乳檢測方法》進行。

1.3.3 感官評定標準

選20名經培訓合格的食品專業人員作為品評員，評定方法如下：以豆乳(豆漿:牛奶體積比為8:2)為對照，采用嗅聞法對不同的酸豆乳打分，并對結果進行方差分析。評分標準：1) 0～2分：無明顯發酵香氣；2) 3～5分：有輕微發酵香氣；3) 6～8分：有正常發酵香氣；4) 9～11分：有濃郁發酵香氣(每個樣品評3次)。LBS1、LHS和LBS2的發酵酸度分別為73、86.6、64.2°T。

1.3.4 樣品處理方法

將首次使用的PDMS固相微萃取頭在氣相色譜進樣口老化至無雜峰，在250℃下老化30min。吸取10mL樣品放入15mL樣品瓶中，在40℃加熱平臺上保持10min，將SPME萃取頭插入瓶中，磁力攪拌速度100r/min，40℃條件下萃取30min。

1.3.5 GC-MS參數條件

色譜條件：色譜柱：毛細管色譜柱DB-WAX(60m ×0.25mm，0.25μm)；進樣口溫度250℃，SPME插入進樣孔解吸3min；程序升溫：始溫35℃，保持3min，以3℃/min升至80℃，再以4℃/min升至120℃，再以10℃/min升至230℃，保持8min；載氣(He)流速1.0mL/ m i n，不分流。

質譜條件：接口溫度280℃，離子源溫度230℃，電子能量70eV，質量掃描范圍33～450u。

1.3.6 定性定量方法

用HP化學工作站軟件對照NIST庫進行數據收集，成分先由譜庫初步鑒定，再結合化學成分的保留時間、質譜、實際成分和保留指數等進行定性；采用面積歸一化法進行相對定量。

2 結果與分析

圖1 豆乳香氣的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of aroma components of soymilk

圖2 酸豆乳LBS1香氣的總離子流圖Fig.2 Total ion chromatogram of aroma components of soymilk yogurt LBS1

圖3 酸豆乳LHS香氣的總離子流圖Fig.3 Total ion chromatogram of aroma components of soymilk yogurt LHS

圖4 酸豆乳LBS2香氣的總離子流圖Fig.4 Total ion chromatogram of aroma components of soymilk yogurt LBS2

豆乳和不同乳酸菌發酵酸豆乳總離子圖見圖1～4。豆乳和不同酸豆乳香氣成分，見表1。

表1 豆乳和酸豆乳香氣成分的分析結果Table1 Analytical results of volatile components in soymilk and different soymilk yogurts

2.1 酸菌發酵對酸豆乳香氣成分的影響

豆乳中共檢測出31種，其中主要香氣成分是醇、醛類，相對含量分別為45.34%和24.12%。含量相對較高的成分有正己醛(22.63%)、正己醇(18.87%)、1-辛烯-3醇(20.26%)和2-戊基呋喃(2.35%)。這與Wang等[6]、Alaoua等[7-8]檢測確定的豆乳主要香氣成分基本相同，通常呈現大豆的青腥氣，這些異味成分是大豆破碎打漿過程中大豆中的亞麻酸、亞油酸等在脂氧合酶及氧氣的共同作用下催化生成的，主要是C6～C9的醛、醇類物質[9-10]。酸豆乳LBS1、LHS和LBS2中分別測出36、3 7和3 4種香氣成分，由酮、酸、醇、醛、酯類和呋喃構成，主要香氣成分是酮、酸、醇和醛類。其中，酮類相對含量為16.35%～23.28%，酸類為13.76%～22.38%，醇類為18.48%～22.70%，醛類為4.34%～5.56%。

分析結果表明，豆乳發酵前后的香氣種類和含量存在明顯差異。發酵后的酸豆乳中酮、酸物質的種類和相對含量明顯增多，而醇、醛物質含量明顯減少，如2,3-丁二酮在豆乳中未檢出，而在LBS1、LHS和LBS2中其相對含量分別達到了5.98%、5.04%和4.42%。這是因為α-乙酰乳酸在微生物作用下被分解成3-羥基丁酮后，進一步氧化生成丁二酮[11]；乙酸由發酵前的0.28%分別增加到6.93%、14.98%和8.22%，主要是因為乳酸菌發酵糖產生了乳酸、乙酸和丙酸等，也可能通過氨基酸代謝生成乙酸、丁酸和戊酸等[12]；但正己醛則由發酵前的22.63%分別降低到發酵后的0.25%、0.15%和0.50%，正己醇從18.87%降低到8.82%、9.81%和10.57%。這是由于豆乳經乳酸菌發酵可將羰基化合物轉化為酮、醇類和有機酸[13]，表明乳酸菌發酵可明顯減輕豆乳的豆腥味，并改善其香氣質量。

2.2 不同菌種發酵對酸豆乳香氣的影響

表2 酸豆乳中主要揮發性香氣的描述及其閾值Table2 Description and odor threshold of volatile compounds in soymilk yogurt LBS1

LBS1共檢測到36種香氣成分，主要由酮、酸、醛、醇和酯類構成。其中酮類10種，相對含量為23.28%，其次是醇類18.48%、酸類14.38%、醛類5.56%和酯類1.03%，它們呈現清香、甜香、醇香、微弱的酸氣和特有的乳酸發酵香。其中占酮類含量18.73%的丁酮類、2-庚酮和3-己酮對LBS1的香氣有較大的影響，它們的閾值較低，主要表現出清香、脂香和甜香(表2)，很可能是其發酵產生的特征香氣成分[14,16,20]。同時，LBS1中重要香氣物質乙醛和丁二酮的含量分別為5.98%和2.06%，均高于LHS和LBS2兩種酸豆乳，且乙醛與丁二酮的含量比值為0.345，與Marilley等[21]、王琴等[22]和Wang等[23]報道的乳酸菌種產香質量的評價指標相近。因此，LBS1呈現的清香、甜香、脂香和乳酸發酵香較LHS、LBS2協調和濃郁。

LHS共檢測到37種香氣成分，主要由酸、酮、醇、醛和酯類構成。其中酸類有5種，相對含量為22.38%，其次是酮類21.42%、醇類19.25%和醛類4.34%。和LBS1相比，LHS中丁酮類和醛類的含量略低。但因LHS中乙酸、己酸和辛酸等酸類所占的相對含量最大，它們的沸點低，揮發濃度高，對LHS香氣影響較大，而揮發濃度低的酮類和醛類對LHS的影響則相對較小，酸類所呈現的尖酸和酪香強于醛酮類[16]。在LHS中，乙醛與丁二酮的含量比為0.286，低于文獻[22]所確定的量比范圍。LHS主要呈現豆乳的發酵清甜香、脂香，但帶有較刺激的酸味。

LBS2共檢測到34種香氣成分，主要由醇、酮、酸和醛類構成，其中醇類相對含量為22.70%、酮類16.35%、酸類13.76%和醛類5.20%。在LBS2的香氣成分中也含有呈甜香的丁酮類以及具有刺激味的乙酸等，但與LBS1、LHS相比，它們的含量相對最低，而閾值較低的正己醇、1-辛烯-3-醇和2-戊基呋喃的相對含量最高，它們占總香氣成分的41.48%，這些醇和呋喃物質呈濃郁的大豆青腥氣[6]。說明此混合菌種還不能很好適應豆乳的發酵，可能沒有將豆乳中的豆腥味化合物轉化為酮酸類，結果只呈現微弱的發酵香。

上述分析表明，3種酸豆乳的香氣主要由清甜香、果香和脂香構成，它們的香氣構成成分、數量和相互比例不同，其呈現的發酵香氣強度不同。LBS1中酮類的相對含量較大，且主要香氣種類量比協調，其具有濃郁的清甜香和奶油香；其次是LHS，其醛酮類含量居中，具有正常的發酵清甜香氣，但因酸類含量過高而帶有刺激、尖酸氣息；LBS2中酮和酸類的相對含量最低，而醇類和呋喃含量最高，其清甜香淡薄，青香突出，發酵香氣最弱。

2.3 發酵菌種對酸豆乳香氣強度的影響

表3 不同酸豆乳的感官評分結果Table3 Results of sensory evaluation results of different soymilk yogurts

方差分析結果：

結果表明，在α＝0.05水平上，酸豆乳之間的差異顯著，品評員之間的差異也顯著。

進一步采用LSD(least significant difference)檢驗不同酸豆乳分數平均值之間的差異。而LBS1、LHS和LBS2的分數平均值分別為9.38、7.15和3.92，任意兩種酸豆乳之間分數平均值的差值均大于0.454，表明任意兩者之間差異顯著，且按照香氣由強到弱排序為LBS1＞LHS＞LBS2。結果說明豆乳經過發酵后其產生的一些香氣物質的種類、含量及其相互比例對酸豆乳的香氣有顯著影響，且不同菌種組合發酵所得酸豆乳的香氣強度存在顯著差異。這與發酵酸豆乳的香氣分析結果及Buono等[24]、Pinthong等[25]和馬永昆[26]的研究結果相吻合，即豆乳發酵時，采用1:1的L.bulgaricus和S.thermophilus發酵得到的酸豆乳的風味最佳。

3 結 論

3.1 經SPME-GC-MS檢測分析，豆乳有31種香氣成分，它們由醇、醛、酮、酸、酯類和呋喃構成，其中以醇、醛類為主，含量分別占45.34%和24.12%。酸豆乳LBS1、LHS和LBS2分別測出36、37、34種香氣成分，它們由酮、酸、醇、醛和酯類構成，以酮、酸、醇和醛類為主，其中酮類占16.35%～23.28%，酸類占13.76%～22.38%，醇類占18.48%～22.70%，醛類僅占4.34%～5.56%。豆乳與發酵酸豆乳的香氣在種類和含量上有明顯差異。

3.23 種發酵酸豆乳的香氣主要由清甜香、脂香和特有的乳酸發酵香構成，它們香氣的構成成分、含量和相互比例不同導致其呈現不同的發酵香氣。進行發酵酸豆乳感官評價，并按照發酵香氣由強到弱的排序為LBS1＞LHS＞LBS2， 即由1:1的L.bulgaricus和S.thermophilus組成的菌種產香濃郁，產酸力高，是豆乳發酵的優選菌種。

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Determination and Evaluation of Volatile Components of Soymilk Yoghurts Fermented by Lactic Acid Bacteria

ZHANG Jia1，MA Yong-kun1,2,*，CUI Feng-jie1，CHEN Fan1，SUN Le-liu2，XIA Rong2
(1. School of Food and Biological Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China；2. Biological Processing and Separation Engineering Technology Research Center of Jiangsu Province, Zhenjiang 212004, China)

The volatile components of the soymilk yoghurts fermented by Streptococcus thermophilus plus Lactobacillus bulgaricus (1:1 or 1:2 mixing ratio) or Lactobacillus helveticus (1:1 mixing ratio) were analyzed using headspace solid phase microextraction (SPME) combined with gas chromatograph/mass spectrometer (GC-MS) and sensory evaluation was conducted for these yoghurt samples. The effects of different species of Lactobacillu and mixing ratio for Lactobacillu and Streptococcus thermophilus on the volatile components of soymilk yoghurts were explored. In comparison with pre-fermented soymilk, all the three soymilk yoghurts showed significantly higher contents of ketones and acids but significantly lower contents of aldehydes and alcohols. The contents of the key flavor compounds found in all of them were different. The results of evaluation were consistent with those of aroma composition analysis. The soymilk yoghurt produced with Streptococcus thermophilus plus Lactobacillus bulgaricus at 1:1 mixing ratio had strong aroma and high acidity. Therefore, an excellent fermentation starter has been found for the production of soymilk yoghurt through this study.

lactic acid bacteria；soymilk yoghurt；SPME；GC-MS；aroma

TS214.2

A

1002-6630(2010)20-0298-05

2009-12-29

江蘇大學高級人才專項(1283000126)

張佳(1982—)，女，碩士研究生，研究方向為食品發酵與風味。E-mail：zhang99jia@163.com

*通信作者：馬永昆(1963—)，男，教授，博士后，研究方向為食品非熱加工、食品風味化學與食品發酵工程。E-mail：mayongkun@ujs.edu.cn