快速高分離液相色譜-串聯質譜法對肌肉組織中糖皮質激素殘留的檢測

高文惠，李 揮，張敬軒

(1.河北科技大學生物科學與工程學院，河北省 石家莊 050018；2.河北省食品質量監督檢驗研究院，河北省 石家莊 050051)

快速高分離液相色譜-串聯質譜法對肌肉組織中糖皮質激素殘留的檢測

高文惠1，李 揮2，張敬軒2

(1.河北科技大學生物科學與工程學院，河北省 石家莊 050018；2.河北省食品質量監督檢驗研究院，河北省 石家莊 050051)

建立采用快速高分離液相色譜-串聯質譜(UHPLC-MS2)技術檢測肌肉組織中糖皮質激素殘留的方法。樣品經乙酸乙酯提取，固相萃取法凈化，以C18色譜柱(150mm×2.1mm，3.5μm)為分離柱，水-乙腈-甲酸溶液為流動相進行梯度洗脫，快速高分離液相色譜-串聯質譜ESI負離子模式進行檢測。該方法線性范圍為0.5～5ng/mL，線性相關系數R2≥0.9963，檢測限：倍氯米松為1.0μg/kg，氫化可的松為2.0μg/kg，其余均為0.5μg/kg。平均回收率為82.75%～91.87%，相對標準偏差≤4.43%(n=5)。

糖皮質激素；固相萃?。灰合嗌V-串聯質譜法

目前國內外對糖皮質激素殘留的檢測方法主要有高效液相色譜法[1-3]、氣相色譜-質譜聯用法[4]、液相色譜-質譜聯用法[5-12]。動物性食品中糖皮質激素殘留分析精度和檢測要求越來越高，而高效液相色譜法的靈敏度較低，選擇性和特異性差，故不適于痕量獸藥殘留檢測要求；采用氣相色譜-質譜聯用法通常需對樣品進行衍生化處理，操作繁瑣；而應用液相色譜-質譜法樣品無需衍生化，且能夠很好地對分析物進行定性確認，目前已成為檢測糖皮質激素殘留的首選方法，而且串聯質譜技術可以更為有效地去除基質中的干擾，保證痕量物質分析的準確性。本實驗采用快速高分離液相色譜-串聯質譜法對肌肉組織中糖皮質激素殘留進行測定，以期為肌肉組織中糖皮質激素殘留方法的建立提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

50種豬肉肌肉組織，由河北省內各地超市和市場隨機抽取。隨機抽取的樣品用冷凍車運輸或置于干冰冷凍箱中運送，于實驗室－20℃下保存。

乙睛為色譜純；正己烷、乙酸乙酯、丙酮、甲酸、氫氧化鈉均為分析純；糖皮質激素標準品(純度均大于98.0%)：倍氯米松(beclomethasone)、倍他米松(betamethasone)、地塞米松(dexamethasone)、醋酸地塞米松(f l u d r o c o r t i s o n e A c e)、氫化可的松(hydrocortisone)、潑尼松龍(prednisolone)、潑尼松(prednisone) 美國Sigma公司。

標準儲備液：分別準確稱取0.1g糖皮質激素類藥物標準品于100mL容量瓶中，用甲醇溶解定容，分別配制成1000μg/mL的溶液作為貯備液。－20℃以下保存?；旌蠘藴使ぷ饕海簻蚀_量取糖皮質激素類藥物標準貯備液適量，用20%乙腈-水溶液稀釋成適宜質量濃度的混合標準工作液，現配現用。

1.2 儀器與設備

Agilent 1200超快速液相色譜-6410串聯質譜聯用儀(配電噴霧離子源) 美國Agilent公司；固相萃取裝置美國Supelco公司；CT15RT高速冷凍離心機、組織搗碎機 美國KAI公司；XH-B旋渦混勻器 江蘇康健醫療用品有限公司；氮吹儀 英國STK公司。

1.3 樣品的前處理

1.3.1 提取

稱取50種肌肉組織(2±0.05)g于50mL離心管中，加乙酸乙酯15mL，旋渦混合，15000r/min離心5min，移取乙酸乙酯層。于殘渣中加0.1mol/L氫氧化鈉溶液10mL，混勻，加乙酸乙酯20mL，漩渦混合，200r/min搖床振動15min，15000r/min離心5min，移取乙酸乙酯層。合并兩次提取液，40℃旋轉蒸至近干，加乙酸乙酯1mL和正己烷5mL，溶解殘渣，待凈化。

1.3.2 凈化

用6mL正己烷活化固相萃取柱，提取液過柱。用正己烷6mL淋洗萃取柱，抽干，用正己烷-丙酮(6:4，V/V)6mL洗脫。洗脫液50℃氮氣吹干，加20%乙腈-水溶液0.5mL，溶解殘渣，轉入1.5mL離心管中，15000r/min離心20min，取上清液，過0.22μm濾膜，超快速液相色譜-串聯質譜法測定。

1.4 色譜和質譜條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：C18色譜柱(150mm×2.1mm，3.5μm)；流動相：A：水，B：乙腈，C：0.2%甲酸水溶液，梯度洗脫程序見表1；柱溫40℃； 進樣量20μL。外標法定量。

表1 流動相梯度洗脫條件Table1 Gradient elution program

1.4.2 質譜條件

離子源：電噴霧離子源；掃描方式：負離子掃描；檢測方式：選擇反應監測；噴霧電壓：4000V；離子傳輸管溫度：330℃；鞘氣壓力：40bar。

2 結果與分析

2.1 色譜和質譜行為

為了提高分析的靈敏度和專一性，選用多反應監測模式(MRM)進行檢測，同時檢測兩對傳輸離子通道，進行定性和定量分析。7種糖皮質激素的定性和定量離子對列于表2中。

表2 糖皮質激素的保留時間和定性、定量離子對Table2 Retention time as well as quantitative and qualitative ion-pairs for seven glucocorticoids

圖1 混合標準溶液色譜圖Fig.1 Chromatogram of mixed solution of five glucocorticoids

在1.4節色譜和質譜條件下，7種糖皮質激素混合標準溶液色譜圖(圖1)，由圖1可以看出，除潑尼松龍、氫化可的松和潑尼松外，其他糖皮質激素實現了良好分離。7種糖皮質激素二級質譜圖如圖2所示。

2.2 線性范圍與檢測限

將糖皮質激素類藥物標準貯備液分別配制成質量濃度為0.25、0.5、1、2、5ng/mL的溶液，以峰面積為縱坐標，標準溶液質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線，其回歸方程和線性相關系數見表2。結果表明本方法在0.5～5ng/mL范圍呈良好線性關系，線性相關系數R2≥0.9963，檢測限(RSN=3)在0.5～2.0μg/kg之間。

表2 糖皮質激素的線性關系和檢測限Table2 Linear regression equations and detection limits of seven glucocorticoids

2.3 回收率和精密度

在空白試樣中加入2.0μg/kg和5.0μg/kg的混合標準溶液，進行回收率實驗，并考察實驗方法的精密度。結果見表3。

由表3可以看出，7種糖皮質激素平均回收率在82.75%～91.87%之間，RSD為2.15%～4.43%。說明本方法的回收率和精密度良好。

表3 不同添加水平回收率和精密度實驗結果(n=5)Table3 Results of recovery and precision tests (n=5)

2.4 樣品測定

分別對50批次豬肉肌肉組織樣本進行編號：1#，2#、3#……49#、50#。倍氯米松、倍他米松、地塞米松、醋酸地塞米松、氫化可的松、潑尼松龍和潑尼松檢測結果均未檢出。隨機選取一個樣本的色譜圖，圖3顯示1#肌肉組織樣本的色譜圖，由圖3可以看出7種糖皮質激素均未檢出。

圖3 1#樣本色譜圖Fig.3 Chromatogram of pork sample 1#

3 結 論

采用UHPLC-MS-MS技術建立肌肉組織中糖皮質類激素殘留的檢測方法，組織樣品用堿水解，乙酸乙酯提取，提取液經固相萃取柱凈化，快速高分離液相色譜-串聯質譜ESI負離子模式進行檢測。使用本方法進行測定時，糖皮質激素在0.5～5ng/mL濃度范圍內，具有良好的線性關系，線性相關系數(R2)≥0.9963，檢測限在0.5～2.0μg/kg之間。在空白試樣中的添加濃度為2.0μg/kg和5.0kg時，平均回收率為82.75%～91.87%，RSD為2.15%～4.43%，說明本方法的回收率和精密度良好。

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Determination of Glucocorticoid Residues in Animal Muscle by Rapid Resolution Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

GAO Wen-hui1，LI Hui2，ZHANG Jing-xuan2
(1. College of Biological Science and Engineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang 050018, China；2. Hebei Institute of Food Quality Supervision, Inspection and Research, Shijiazhuang 050051, China)

A method was developed for the determination of seven glucocorticoid residues in animal muscle using liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Sample extraction was performed using ethyl acetate, followed by cleanup based on solid phase extraction (SPE). The chromatographic separation was achieved on a C18column (150 mm×2.1 mm, 3.5μm) with water/acetonitrile/formic acid system as the mobile phase in gradient elution mode. The MS condition used was negative electrospray ionization mode. Under these conditions, the linear range of the developed method was between 0.5 ng/mL and 5 ng/mL, with a linear correlation coefficient of no less than 0.9963, the detection limit was 1.0μg/kg for beclomethasone, 2.0 μg/kg for hydrocortisone, 0.5μg/kg for the others, and the average spike recoveries for the seven molecules were between 82.75% and 91.87%, with a relative standard deviation (RSD) of 4.43% or lower (n = 5).

glucocorticoid；solid phase extraction；liquid chromatography-tandem mass spectrometry

TS207.3

A

1002-6630(2010)20-0382-04

2010-06-13

河北省科技廳重大科技攻關項目(09227134D)；河北省科技支撐計劃項目(10276902D)；河北省自然科學基金項目(B2008000669)

高文惠(1963—)，女，教授，博士，研究方向食品安全與分離科學。E-mail：wenhuigao@126.com