枯草芽孢桿菌B26生產(chǎn)多隔鐮孢霉抑制物工藝優(yōu)化

張麗珍，耿海峰，樊晶晶，牛 偉，紀(jì) 春，趙婷婷， 牛 宇

(1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006；2.山西大學(xué)生物工程學(xué)院，山西 太原 030006；3.山西大學(xué)生物技術(shù)研究所，山西 太原 030006；4.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，山西 太原 030006；5.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源綜合考察研究所，山西 太原 030006)

枯草芽孢桿菌B26生產(chǎn)多隔鐮孢霉抑制物工藝優(yōu)化

張麗珍1，耿海峰2，樊晶晶3，牛 偉4，紀(jì) 春3，趙婷婷2， 牛 宇5

(1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006；2.山西大學(xué)生物工程學(xué)院，山西 太原 030006；3.山西大學(xué)生物技術(shù)研究所，山西 太原 030006；4.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，山西 太原 030006；5.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源綜合考察研究所，山西 太原 030006)

采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)枯草芽孢桿菌B26抑制多隔鐮孢霉培養(yǎng)基配方及用量進(jìn)行優(yōu)化，單因素試驗(yàn)對(duì)B26產(chǎn)生活性物質(zhì)的發(fā)酵條件進(jìn)行選擇。以多隔鐮孢霉的抑制率為指標(biāo)，B26產(chǎn)生拮抗效果最好的發(fā)酵培養(yǎng)基配方用量是：蛋白胨25g/L、淀粉45g/L 、氯化鈉1.5g/L、硫酸銨1.0g/L、磷酸氫二鉀1.5g/L。產(chǎn)生活性物質(zhì)的最優(yōu)發(fā)酵條件為：種子菌齡24h、接種量5%、初始pH7、裝液量20%、吐溫-80用量0.5%、發(fā)酵溫度30℃、轉(zhuǎn)速150r/min、發(fā)酵時(shí)間60h，獲得B26菌株發(fā)酵液對(duì)多隔鐮孢霉的抑制直徑為26mm，優(yōu)于其他條件培養(yǎng)獲得的拮抗效果。

多隔鐮孢霉；生物防治；正交試驗(yàn)；發(fā)酵條件

由多隔鐮孢霉(Fusarium decemcellulare Brick)引起的黑斑病對(duì)采后冬棗產(chǎn)量和品質(zhì)產(chǎn)生嚴(yán)重影響。應(yīng)用微生物拮抗菌產(chǎn)生的活性物質(zhì)進(jìn)行水果采后病害防治是目前生物防治的一種主要方式[1-3]。枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)代謝產(chǎn)物除具有其他微生物代謝產(chǎn)物所具有培養(yǎng)周期短，生產(chǎn)方便，儲(chǔ)藏期相對(duì)較長(zhǎng)優(yōu)點(diǎn)外，還具有耐熱、抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)，具有作為工業(yè)生防菌的優(yōu)勢(shì)[4-6]。但是在實(shí)際生產(chǎn)中，抗菌物質(zhì)的產(chǎn)生水平不僅取決于生

產(chǎn)菌種本身的性能，還與拮抗菌代謝過(guò)程中各種環(huán)境條件(包括營(yíng)養(yǎng)條件[8-9]和培養(yǎng)條件[10])密切相關(guān)，即活性物質(zhì)產(chǎn)量的多少受營(yíng)養(yǎng)條件、p H值、溫度、通氣量、發(fā)酵時(shí)間等諸多因素影響。為了使發(fā)酵產(chǎn)物的生產(chǎn)水平達(dá)到最佳效果，通過(guò)優(yōu)化菌株的發(fā)酵條件和工藝以提高菌量及抗菌物質(zhì)產(chǎn)率是必要的。

本實(shí)驗(yàn)所用枯草芽孢桿菌菌株B26為本實(shí)驗(yàn)室分離、篩選、鑒定和保存的優(yōu)良拮抗菌株。該菌對(duì)細(xì)交鏈格孢(Alternaria alternata)、多隔鐮孢霉(Fusarium decemcellulare Brick)和串珠霉(Monilia fructicola)等都有較好抑制作用，具有很好的應(yīng)用前景[7]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)該菌產(chǎn)生拮抗活性物質(zhì)的培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，為下一步生物農(nóng)藥開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供參考，以期有效減少水果腐爛所帶來(lái)的損失。

1 材料與方法

1.1 菌種

枯草芽孢桿菌B26由本實(shí)驗(yàn)室分離保存。

供試病原菌：多隔鐮孢霉(Fusarium decemcellulare Brick) 由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院保鮮所惠贈(zèng)。

1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯(去皮)200g、葡萄糖20g、瓊脂20g、H2O 1μL；種子培養(yǎng)基：蛋白胨5g、酵母膏3g、葡萄糖2g、牛肉膏1g、H2O 1μL；液體發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨25g、淀粉40g、NaCl 1.5g、 (NH4)2SO40.8g、K2HPO41.5g、H2O 1L，pH7.0。

1.3 儀器與設(shè)備

BS-S恒溫振蕩器、HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國(guó)華電器有限公司；HH.BII.600電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療機(jī)械廠；可調(diào)式微量移液器 熱電上海儀器有限公司；YXQ-LS-50壓力蒸汽滅菌鍋、SW-CJ-1FD潔凈工作臺(tái) 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠； TGL-16G-C高速臺(tái)式冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠； 752PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；3-Star酸度計(jì) 美國(guó)奧立龍公司。

1.4 方法

1.4.1 發(fā)酵培養(yǎng)基基礎(chǔ)成分的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)因素及水平見(jiàn)表1，淀粉及礦質(zhì)元素按正交配方加入2.5%蛋白胨，pH值自然，滅菌備用。

表1 培養(yǎng)基成分的正交試驗(yàn)的因素和水平Table 1 Factors and levels in orthogonal array design

1.4.2 拮抗菌發(fā)酵液抑菌活性測(cè)定

挑取在PDA培養(yǎng)基上過(guò)夜活化的B26單菌落，接種到種子培養(yǎng)基內(nèi)30℃、150r/min培養(yǎng)24h后，以5%的接種量接入滅菌的1～9號(hào)培養(yǎng)基內(nèi)，設(shè)3次重復(fù)，30℃、150r/min 振蕩培養(yǎng)24h。采用平板涂布打孔法測(cè)定發(fā)酵液抑菌活性。將指示菌制成菌懸液(1×108CFU/mL)，吸取200μL均勻涂布于PDA平板上，待培養(yǎng)基表面風(fēng)干后用打孔器(直徑6mm)打孔，吸取50μL菌液加入孔中，37℃下培養(yǎng)5d，并設(shè)置不接種的相同培養(yǎng)基制備的空白液為對(duì)照，觀察并記錄不同培養(yǎng)基配方組合下的B26菌液抑菌圈直徑和發(fā)酵菌液的光密度值(OD600nm)，通過(guò)極差分析和方差分析確定發(fā)酵培養(yǎng)基基礎(chǔ)配方。

1.4.3 不同碳源對(duì)抑菌作用的影響

分別取淀粉、葡萄糖、蔗糖、淀粉、麥芽糖、乳糖、麩皮和糠皮作為液體發(fā)酵培養(yǎng)基成分中的碳源，制成不同碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃、150r/min振蕩培養(yǎng)24h。

1.4.4 不同氮源對(duì)抑菌作用的影響

分別取蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、硝酸銨、硫酸銨和硝酸鉀作為液體發(fā)酵培養(yǎng)基成分中的氮源，制成不同氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃、150r/min振蕩培養(yǎng)24h。

1.4.5 不同初始pH值對(duì)抑菌作用的影響

用0.5mol/L鹽酸和0.5mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)液體發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0。1.4.6吐溫-80的不同加入比例對(duì)抑菌作用的影響

取吐溫-80按體積分?jǐn)?shù)0.05%、0.1%、0.5%、1%、1.5%、2%添加到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，以不加吐溫-80作對(duì)照。

1.4.7 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)抑菌作用的影響

采用液體發(fā)酵培養(yǎng)基，設(shè)置6、12、24、36、48、72、84h 7個(gè)處理。

1.4.8 不同培養(yǎng)溫度對(duì)抑菌作用的影響

采用液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基，設(shè)置25、30、35、40、45℃ 5個(gè)處理。

1.4.9 不同接種量對(duì)抑菌作用的影響

分別按1%、2%、5%、10%、15%、20% 6個(gè)梯度將種子培養(yǎng)液加入液體發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.4.10 不同裝液量對(duì)抑菌作用的影響

將液體發(fā)酵培養(yǎng)基按照10、25、50、100、150、125、200mL 7個(gè)處理裝入250mL的三角瓶中。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)利用不同培養(yǎng)基配方培養(yǎng)出的拮抗菌B26菌液的打孔實(shí)驗(yàn)的拮抗直徑結(jié)果進(jìn)行極差和方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3、4。

表2 試驗(yàn)結(jié)果的極差分析Table 2 Orthogonal array design matrix and experimental results

表3 試驗(yàn)結(jié)果的方差分析Table 3 Analysis of variance for the diameter of inhibition circle with various medium components

由表3、4可知，經(jīng)極差分析和方差分析獲得的結(jié)果一致，各因素主次順序均為磷酸氫二鉀＞硫酸銨＞淀粉，由此得到培養(yǎng)基最優(yōu)配方用量：蛋白胨25g/L、淀粉45g/L、氯化鈉1.5g/L、硫酸銨1.0g/L、磷酸氫二鉀1.5g/L。以最優(yōu)配方為基準(zhǔn)進(jìn)行單因子試驗(yàn)，具體包括：碳源、氮源、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)液的初始pH值、吐溫-80的加入量、接種量、加液量，通過(guò)比較不同培養(yǎng)基配方下的拮抗直徑來(lái)確定最優(yōu)培養(yǎng)條件。

2.2 不同碳源對(duì)抑菌作用的影響

圖1 不同碳源條件下的拮抗直徑和OD600nmFig.1 Effect of carbon sources on the production ofFusarium decemcellulareBrick inhibitor

由圖1可知，當(dāng)使用麥芽糖和葡萄糖為碳源時(shí)，拮抗效果較好，抑菌直徑分別達(dá)到22.5、22.3mm，同時(shí)發(fā)現(xiàn)使用麩皮也可以達(dá)到較好的抑制效果，抑菌直徑為21.7mm。因此在大規(guī)模生產(chǎn)中可以考慮以來(lái)源廣價(jià)格低的麩皮作為碳源生產(chǎn)拮抗菌的活性物質(zhì)。

2.3 不同氮源對(duì)拮抗直徑的影響

圖2 不同氮源條件下的拮抗直徑和OD600nmFig.2 Effect of nitrogen sources on the production ofFusarium decemcellulareBrick inhibitor

由圖2可知，在不同氮源下，包括無(wú)機(jī)氮源和有機(jī)氮源，枯草芽孢桿菌B26均能生長(zhǎng)，并產(chǎn)生具有拮抗活性的物質(zhì)。無(wú)機(jī)氮源中，以硝酸銨為氮源的培養(yǎng)基拮抗效果最好，達(dá)到21.2mm；有機(jī)氮源中酵母粉的抑菌效果最好，為20.5mm。

2.4 初始pH值對(duì)抑菌作用的影響

圖3 培養(yǎng)基不同pH值的拮抗直徑和OD600nmFig.3 Effect of initial medium pH on the production ofFusarium decemcellulareBrick inhibitor

由圖3可知，在不同初始pH值條件下，拮抗菌的生物量不同，拮抗效果也不同：表現(xiàn)為隨著pH值升高，拮抗直徑逐漸變大。到pH7時(shí)最大；隨著pH值繼續(xù)升高，拮抗直徑逐漸變小，但變化幅度不大。表明枯草芽孢桿菌B26在偏酸或偏堿性條件下都能生長(zhǎng)，但在pH7的條件下產(chǎn)生的拮抗活性物質(zhì)對(duì)病菌拮抗直徑最大，達(dá)到21.0mm。

2.5 吐溫-80用量對(duì)抑菌作用影響

由圖4可知，吐溫-80在體積分?jǐn)?shù)0.5%時(shí)，B26 OD600nm值最大，菌體濃度最高；此時(shí)B26菌液對(duì)病菌抑菌圈直徑最大。

圖4 吐溫-80不同體積分?jǐn)?shù)的拮抗直徑和OD600nmFig.4 Effect of Tween -80 amount on the production ofFusarium decemcellulareBrick inhibitor

2.6 培養(yǎng)溫度對(duì)抑菌作用的影響

圖5 不同培養(yǎng)溫度的拮抗直徑和OD600nmFig.5 Effect of culture temperature on the production ofFusarium decemcellulareBrick inhibitor

由圖5可知，在30℃以前，隨著溫度的升高，拮抗直徑逐漸升高(OD600nm持續(xù)到35℃，可能培養(yǎng)液中已產(chǎn)生細(xì)菌死菌體所致)，但到達(dá)30℃以后，隨著溫度的升高，拮抗直徑逐漸變小，呈梯度變小的趨勢(shì)。在30℃，雖然OD600nm不是最大的，但拮抗效果最好，拮抗直徑達(dá)到23.3mm，從而獲得拮抗菌B26的最佳發(fā)酵培養(yǎng)溫度為30℃。

2.7 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)抑菌作用的影響

圖6 不同培養(yǎng)時(shí)間下的拮抗直徑和OD600nmFig.6 Effect of culture time on the production ofFusarium decemcellulareBrick inhibitor

由圖6可知，枯草芽孢桿菌B26是在60h后進(jìn)入穩(wěn)定期，枯草芽孢桿菌的菌體量達(dá)到最多，此時(shí)產(chǎn)生的拮抗活性物質(zhì)較多，抑菌效果保持相應(yīng)較高的水平。

2.8 接種量對(duì)抑菌作用的影響

由圖7可知，隨著枯草芽孢桿菌B26種子培養(yǎng)基加入量逐漸加大，拮抗直徑逐漸變大，但在加入量達(dá)到5%之后，抑菌直徑增加幅度很小(24～24.8mm)。

圖7 不同接種量的拮抗直徑和OD600nmFig.7 Antagonistic diameters and OD600nmat different inoculum sizes

2.9 裝液量對(duì)抑菌作用的影響

圖8 不同裝液量的拮抗直徑和OD600nmFig.8 Antagonistic diameters and OD600nmat different aeration rates

由圖8可知，裝液量為20%時(shí)，拮抗效果最好，拮抗直徑為22.3mm；隨著加液量的增加，過(guò)多的裝液量限制了微生物產(chǎn)生拮抗物質(zhì)，拮抗直徑也逐漸變小。

3 結(jié) 論

3.1 通過(guò)正交試驗(yàn)確定拮抗菌產(chǎn)生活性物質(zhì)的最佳配方比例是：蛋白胨25g/L，淀粉45g/L，氯化鈉1.5g/L、硫酸銨1.0g/L、磷酸氫二鉀1.5g/L。

3.2 產(chǎn)生活性物質(zhì)的最佳發(fā)酵工藝：種子培養(yǎng)24h后，按照5%的接種量接入初始pH7，吐溫-80體積分?jǐn)?shù)0.5%，裝液量為20%的最優(yōu)液體發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)，在30℃、轉(zhuǎn)速為150r/min，發(fā)酵培養(yǎng)60h后獲得拮抗菌抑制多隔鐮孢霉的抑制直徑可達(dá)26mm，大于其他條件的拮抗直徑。

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Optimization of Medium Composition and Fermentation Conditions for the Production of Fusarium decemcellulare Brick Inhibitor by Bacillus subtilis B26

ZHANG Li-zhen1，GENG Hai-feng2，F(xiàn)ANG Jing-jing3，NIU Wei4，JI Chun3，ZHAO Ting-ting2，NIU Yu5
(1. College of Life Science, Shanxi University, Taiyuan 030006, China；2. College of Biological Engineering, Shanxi University, Taiyuan 030006, China；3. Institute of Biotechnology, Shanxi University, Taiyuan 030006, China；4. Shanxi Academy of Agricultural Sciences,Taiyuan 030006, China；5. Integrated Review Institute of Agriculture Resources, Shanxi Academy of Agricultural Sciences, Taiyuan 030006, China)

A four-factor, three-level orthogonal array design was employed to optimize four medium components for the production of Fusarium decemcellulare Brick inhibitor by Bacillus subtilis B26, and the effects of fermentation conditions on the production of Fusarium decemcellulare Brick inhibitor were explored through single factor experiments. The optimal medium composition for maximizing inhibition rate against Fusarium decemcellulare Brick was found to be composed of peptone 25 g/L, starch 45 g/L, sodium chloride 1.5 g/L, ammonium sulfate 1.0 g/L, and dipotassium hydrogen phosphate 1.5 g/L. Seed age of 24 h, inoculmum size of 5%, initial pH of 7, the volume of medium in the fermentation vessel of 20%, the amount of added Tween -80 of 0.5%, fermentation temperature of 30 ℃, rotational speed of 150 r/min and fermentation period of 60 h were found optimal. The inhibition circle diameter of the fermentation broth obtained under these conditions was 26 mm.

Fusarium decemcellulare Brick；biological control；orthogonal array design；fermentation conditions

Q939.1

A

1002-6630(2010)23-0128-04

2010-06-28

“十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2006BAD01A16)；山西省留學(xué)人員科研項(xiàng)目(2008-119)；山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目(20100311001-7)；山西省高校學(xué)科建設(shè)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(2010)

張麗珍(1977—)，女，副教授，博士，研究方向?yàn)樯镔Y源篩選及利用。E-mail：lizhen@sxu.edu.cn