白鰱魚肌肉脂肪氧合酶的分離純化與鑒定

王衛東，楊萬根，付湘晉*

(1.徐州工程學院食品學院，江蘇 徐州 221008；2.江南大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122；3.中南林業科技大學食品科學與工程學院，湖南 長沙 410004)

白鰱魚肌肉脂肪氧合酶的分離純化與鑒定

王衛東1,2，楊萬根1,2，付湘晉2,3,*

(1.徐州工程學院食品學院，江蘇 徐州 221008；2.江南大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122；3.中南林業科技大學食品科學與工程學院，湖南 長沙 410004)

采用硫酸氨沉淀和羥基磷灰石柱層析法分離白鰱魚肌肉脂肪氧合酶(lipoxygenase，LOX)，同時采用反相高效液相(RP-HPLC)檢測其反應產物，對鰱魚肌肉LOX進行鑒定，并研究鰱魚肌肉LOX的底物特異性。結果表明：白鰱魚肌肉LOX催化花生四烯酸主要形成12-氫過氧化物，12-LOX是鰱魚肌肉中主要的LOX；白鰱魚LOX的最適底物是亞麻酸。

白鰱魚；脂肪氧合酶；分離純化；鑒定；反相高效液相

脂肪氧合酶(lipoxygenase，LOX，EC 1.13.11.12)催化不飽和脂肪酸的加氧反應，生成的氫過氧化物裂解生成揮發性的醛類和醇類，從而對食品的風味產生很大影響。LOX是大豆產生豆腥味以及禽肉在凍藏過程中產生酸敗的重要催化劑[1]。不同的LOX催化不同的脂肪酸產生的風味完全不同，在魚油中添加LOX可以產生魚肉風味[2]。Josephson等[3]發現，當魚肉中添加LOX抑制劑S n C l2后，魚肉揮發性風味物質的總量降低。所以，LOX在形成魚肉獨特風味的過程中具有重要作用。

在雞肉[1]、南美對蝦[2]、鮭魚(trout)[4]、豬肉[5-6]、灰鯔魚(gray mullet)[7]和大西洋鯖魚(Atlantic mackerel)[8]等肉類食品及水產品中都檢測到LOX酶活力，但白鰱魚中還未見到有關LOX的報道。本研究從鰱魚肌肉中提取LOX，采用硫酸銨沉淀和羥基磷灰石柱層析法初步分離純化LOX，并采用反相高效液相(RP-HPLC)對鰱魚肌肉LOX的類型進行鑒定，為鰱魚的資源利用和鰱魚風味形成機制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

鮮活鰱魚 市購。

亞油酸、亞麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA) 美國Sigma公司；花生四烯酸過氧化物(HETE)標樣 美國Caymen試劑公司；其他試劑均為分析純。

Agilent1200高效液相色譜儀 美國安捷倫公司；

LC-B自動液相色譜電腦層析分離系統 上海康華生化儀器制造有限公司。

1.2 鰱魚肌肉LOX的分離純化

參照Gata等[5]的方法對鰱魚肌肉中的LOX進行了分離純化。手工采集新鮮魚肉，添加4倍體積50mmol/L磷酸鹽緩沖液(含1mmol/L二硫代蘇糖醇、1mmol/L EDTA)勻漿(10000r/min，1min)；再10000×g冷凍離心60min。上清液用研磨細的無水硫酸氨沉淀。沉淀用磷酸鹽緩沖液(50mmol/L、pH7.4)溶解，用羥基磷灰石柱(hydroxyapatite，HA，1.5cm×30cm)除血色素蛋白(如血紅蛋白、肌紅蛋白)。HA柱用50mmol/L磷酸鹽緩沖液(含5mmol/L還原型谷胱甘肽)平衡，流速為1.0mL/min。用0.3mol/L磷酸鹽緩沖液(含5mmol/L還原型谷胱甘肽)洗脫，流速1.0mL/min。收集有LOX酶活力的組分，并用截留分子質量為3×104D的超濾膜過濾濃縮，濃縮液保存在4℃冰箱，并在兩天內使用。所有操作溫度控制在5℃以下。

1.3 白鰱魚肌肉LOX酶活力測定

用紫外分光光度法測定LOX活力。以Tween-20 (最終體積分數0.1%)為乳化劑，將亞油酸(最終濃度10mmol/L)分散在10mmol/L硼酸緩沖液(pH9.0)中。250μL上述亞油酸底物和50μL LOX酶(蛋白質質量濃度2mg/mL)添加到1.7mL反應介質中(50mmol/L磷酸緩沖液，pH7.4)，立刻計時，測定其在234nm波長處的吸光度的增加。以每分鐘吸光度增加0.001定義為1個酶活力單位(U)，比活力為每分鐘每毫克蛋白的活力單位數[9]。

1.4 白鰱魚肌肉LOX鑒定

按照Saeed等[8]的方法鑒定從白鰱魚肌肉中分離純化到的LOX的類型。以Tween-20(最終體積分數0.1%)為乳化劑，將花生四烯酸(最終濃度100μmol/L)分散在0.05mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4)中。把LOX (最終濃度42.6U/mL) 和還原型谷胱甘肽(最終濃度1mmol/L)加入到花生四烯酸乳化液中，25℃反應15min。反應產物用兩倍體積乙酸乙酯萃取，有機相減壓旋轉蒸發濃縮(30℃)，殘余液體再用混合溶劑(醋酸-甲醇-水體積比為0.1:65:35)稀釋后用于高效液相分析。高效液相色譜條件為：C18柱，234nm檢測，流動相為醋酸-甲醇-水體積比為0.1:65:35，流速1mL/min。

1.5 白鰱魚肌肉LOX底物特異性測定

采用與制備亞油酸分散液相同的方法制備亞麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)分散液；測定LOX催化亞油酸、亞麻酸、花生四烯酸、EPA、DHA氧化時的酶活力，以其中最高酶活力為100%，計算白鰱魚LOX催化不同脂肪酸氧化時的相對酶活力，即為白鰱魚LOX的底物特異性[2]。

2 結果與分析

2.1 白鰱魚肌肉中LOX分布

表1 白鰱魚組織中LOX酶活力分布(n=3)Table 1 LOX activities (U/g meat) in different tissues of silver carp (n=3)

由表1可知，紅肉中LOX酶活力最高為(104.20± 2.01)U/g魚肉，白肉中LOX酶活力最低，為(42.65±0.20)U/g魚肉；而豬肉中LOX活力約為4.87～12.55U/g蛋白[6]，所以白鰱魚肉中LOX活力是較高的。

2.2 白鰱魚肌肉中LOX分離純化

圖1 鰱魚肌肉脂肪氧合酶的分離純化Fig.1 Ammonium sulfate precipitation and hydroxylapatite column chromatographic fractionation of LOX from silver carp muscle

在脂肪氧合酶性質研究中最主要的干擾蛋白是血紅蛋白，可以采用羥基磷灰石柱分離LOX和血紅蛋白[2,5]。從圖1A可以看出，在硫酸銨飽和度高于40%后，酶活力回收率增加速度降低明顯，所以收集硫酸銨飽和度40%的組分比較合適，酶活力回收率在50%左右。從圖1B可以看出，LOX活力主要集中在0.3mol/L鹽洗脫液中，這與前人的研究結果一致[2,5]。

2.3 白鰱魚肌肉LOX的鑒定

圖2 花生四烯酸氧化產物的RP-HPLC圖譜Fig.2 RP-HPLC chromatographic profiles of oxidation products of arachidonic acid under the catalysis of silver carp LOX and oxidized arachidonic acid standard

LOX特異催化含有cis，cis-1,4-戊二烯結構的多元不飽和脂肪酸的加氧反應，動物來源的LOX根據其催化花生四烯酸氧化時加氧位置進行分類，分成5-LOX、12-LOX、15-LOX等[10]。反相高效液相(RP-HPLC)是檢測花生四烯酸氧化產物異構體的有效方法。經過羥基磷灰石柱層析純化后的白鰱魚肌肉LOX，催化花生四烯酸氧化的產物用RP-HPLC檢測結果如圖2所示。LOX催化花生四烯酸氧化產物的RP-HPLC圖譜為一個大峰和兩個小峰(圖2A)；根據HETE標準品的RP-HPLC圖譜(圖2B)，白鰱魚LOX催化花生四烯酸的氧化產物主要是12-HETE。另外，LOX圖譜中的兩個小峰分別是8-HETE和5-HETE。

花生四烯酸自動氧化產物在RP-HPLC圖譜上有5個峰，分別是5-HETE、8-HETE、11-HETE、12-HETE、15-HETE[8]。與此不同，白鰱魚肉中LOX催化花生四烯酸氧化產物主要是12-HETE(圖2A)，所以，白鰱魚肉中的LOX主要是12-LOX。不同肉中LOX的類型不同，如鮭魚(trout)[4]和大西洋鯖魚[8]是12-LOX，而雞肉中是15-LOX[1]。

2.4 白鰱魚肌肉LOX底物特異性

由表2可知，白鰱魚LOX的最適底物是亞麻酸。不同來源的LOX的底物特異性各不相同，如植物中的LOX的最適底物一般是亞油酸，哺乳動物的LOX的最適底物一般是花生四烯酸；但魚類的LOX的最適底物變化較大，如鮭魚(trout)的LOX的最適底物是DHA[4]，而沙丁魚的LOX的最適底物是亞麻酸[11]。

表2 白鰱魚LOX底物特異性Table 2 Substrate specificity of silver carp LOX

3 結 論

通過實驗證明，白鰱魚肌肉中存在脂肪氧合酶(LOX)。羥基磷灰石柱層析法能有效分離白鰱魚肌肉LOX，反相高效液相(RP-HPLC)檢測其反應產物證明白鰱魚肌肉中的LOX主要是12-LOX，白鰱魚紅肉中LOX的活力最高，白鰱魚肌肉LOX最適底物是亞麻酸。LOX能催化脂肪氧化、產生特征風味和腥味，其對鰱魚品質的影響需要進一步研究。

[1]GROSSMAN S, BERGMAN M, SKLAN D. Lipoxygenase in chicken muscle[J]. J Agric Food Chem, 1988, 36(6): 1268-1270.

[2]楊文鴿, 薛長湖, 何雄, 等. 南美白對蝦血淋巴脂肪氧合酶的分離純化及其生化特性研究[J]. 中國食品學報, 2006, 6(3): 31-37.

[3]JOSEPHSON D B, LINDSAY R C, STUIBER D A. Biogenesis of lipid-derived volatile aroma compounds in the emerald shiner (Notropis atherinoides)[J]. J Agric Food Chem, 1984, 32(6): 1347-1352.

[4]GERMAN J B, CREVELING R K. Indentification and characterization of a 15-lipoxygenase from fish gills[J]. J Agric Food Chem, 1990, 38 (12): 2144-2147.

[5]GATA J L, PINTO M C, MACIAS P. Lipoxygenase activity in pig muscle: purification and partial characterization[J]. J Agric Food Chem, 1996, 44(9): 2573-2577.

[6]郇延軍, 周光宏, 徐幸蓮, 等. 金華火腿生產過程中脂質氧化及脂肪氧合酶變化特點研究[J]. 食品科學, 2008, 29(3): 60-65.

[7]HSU H H, PAN B S. Effect of protector and hydroxypatite partial purification on stability of lipoxygenase from gray mullet gill[J]. J Agric Food Chem, 1996, 44(3): 741-745.

[8]SAEED S, HOWELL N K. 12-Lipoxygenase activity in the muscle tissue of Atlantic mackerel (Scomber scombrus) and its prevention by antioxidants[J]. J Sci Food Agric, 2001, 81(8): 745-750.

[9]YOSHIE-STARK Y, WASCHE A. Characteristics of crude lipoxygenase from commercially de-oiled lupin flakes for different types of lupins (Lupinus albus, Lupinus angustifolius)[J]. Food Chemistry, 2004, 88 (2): 287-292.

[10]BRUCE GERMAN J, CHEN S E, KINSELLA J E. Lipid oxidation in fish tissue. Enzymatic initiation via lipoxygenase[J]. J Agric Food Chem, 1985, 33(4): 680-683.

[11]MOHRI S, CHO S Y, ENDO Y, et al. Linoleate 13(S)-Lipoxygenase in sardine skin[J]. J Agric Food Chem, 1992, 40(4): 573-576.

Separation, Purification and Identification of Lipoxygenase from Silver Carp Muscle

WANG Wei-dong1,2，YANG Wan-gen1,2，FU Xiang-jin2,3,*
(1. College of Food Engineering, Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou 221008, China；2. State Key Labarotory of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China ；3. School of Food Science and Engineering, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, China)

The separation and purification of lipoxygenase (LOX) from silver carp muscle were achieved by using ammonium sulfate precipitation and subsequent hydroxylapatite column chromatographic fractionation. Besides, the oxidation products of arachidonic acid under the catalysis of this enzyme were analyzed by reversed-phase HPLC (RP-HPLC) with the aim of identification, and its substrate specificity was also explored. Arachidonic acid was mainly transformed into 12-hydroxyeicosatetraenoic acid (12-HETE) under the catalysis of the LOX enzyme, suggesting that the main type of LOX in silver carp muscle is 12-LOX. Furthermore, the optimal substrate for this enzyme was linolenic acid.

silver carp；lipoxygenase；purification；identification；RP-HPLC

TS251.5

A

1002-6630(2010)23-0157-03

2010-03-21

中南林業科技大學人才引進基金項目(104-0107)

王衛東(1975—)，男，講師，博士，研究方向為食品酶學。E-mail：yangtzfu@yahoo.com.cn

*通信作者：付湘晉(1980—)，男，講師，博士，研究方向為水產品加工。E-mail：yangtzfu@yahoo.com.cn