冬蟲(chóng)夏草液體發(fā)酵富硒大豆對(duì)脂類(lèi)和硒含量的影響

蔣盛巖，王瑤瓊，趙良忠*

(邵陽(yáng)學(xué)院生物與化學(xué)工程系，湖南 邵陽(yáng) 422000)

冬蟲(chóng)夏草液體發(fā)酵富硒大豆對(duì)脂類(lèi)和硒含量的影響

蔣盛巖，王瑤瓊，趙良忠*

(邵陽(yáng)學(xué)院生物與化學(xué)工程系，湖南 邵陽(yáng) 422000)

采用冬蟲(chóng)夏草菌絲體發(fā)酵富硒大豆，對(duì)冬蟲(chóng)夏草菌絲體發(fā)酵富硒大豆不同時(shí)間發(fā)酵液的脂類(lèi)總量、酸價(jià)、碘價(jià)、游離脂肪酸、硒含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明：發(fā)酵48h的發(fā)酵液與對(duì)照相比，脂類(lèi)總量變化不明顯，酸價(jià)增加2.8倍，碘價(jià)增加1.2倍，亞麻酸、亞油酸、油酸、花生四烯酸分別增加5.3、2.9、6.8倍和5.6倍。48h以后發(fā)酵液中脂類(lèi)成分變化不明顯。不同時(shí)間發(fā)酵液中硒含量基本不變。

冬蟲(chóng)夏草；發(fā)酵；富硒大豆；脂類(lèi)物質(zhì)；硒

生物轉(zhuǎn)化是利用微生物代謝過(guò)程中產(chǎn)生的酶將無(wú)效或低效成分變?yōu)橛行Щ蚋咝С煞?，又稱(chēng)微生物酶法轉(zhuǎn)化，生物轉(zhuǎn)化在食品、醫(yī)藥方面有著廣泛的應(yīng)用前景[1]。食藥用菌在液體培養(yǎng)過(guò)程中，除菌絲體或孢子大量增殖外，還會(huì)在發(fā)酵液中產(chǎn)生多糖、多肽、生物堿、萜類(lèi)化合物、酚類(lèi)、甾醇、酶、核酸、氨基酸、維生素等多種生理活性物質(zhì)，具有抗炎、抗菌、抗癌、抗衰老、抗?jié)儭⑻岣呙庖吡胺垒椛涞裙π?；食藥用菌液體發(fā)酵可以制備食藥用菌飲料、調(diào)味品、食品添加劑等[2-3]。

脂類(lèi)作為生物細(xì)胞中各種膜性結(jié)構(gòu)的基本成分及人體血漿中脂蛋白的必需成分，對(duì)人體有多種營(yíng)養(yǎng)和保健作用[4-5]：1)抗衰老作用；2)維持神經(jīng)系統(tǒng)的激動(dòng)性，增強(qiáng)記憶功能；3)刺激細(xì)胞增生，促進(jìn)血液循環(huán)；4)維持皮膚穩(wěn)態(tài)；5)降血脂、降血糖，防止動(dòng)脈粥樣硬化；6)健腦抗疲勞作用；7)抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用；8)利于維生素的吸收。大豆油脂成分能抑制血膽固醇上升[6]。

硒是人體必須的微量元素，缺硒會(huì)導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生，如克山病、大骨節(jié)病、心肌病、癌癥等，適量的攝入硒能增強(qiáng)機(jī)體免疫力、防癌、抗癌、抗衰

老[7-8]。研究表明，以無(wú)機(jī)硒作為硒源不但存在一定毒性，而且生物利用率低，如果通過(guò)一定的轉(zhuǎn)化方法將無(wú)機(jī)態(tài)硒轉(zhuǎn)化為有機(jī)態(tài)硒，則能克服無(wú)機(jī)硒作為硒補(bǔ)充劑的弊端[9]。經(jīng)轉(zhuǎn)化后的有機(jī)硒主要以富硒蛋白的形式存在于有機(jī)體中，與無(wú)機(jī)硒相比，富硒蛋白吸收利用率高，生物活性強(qiáng)，具有更顯著的抗腫瘤、抗癌等藥理作用[10]。中國(guó)是一個(gè)缺硒大國(guó)，補(bǔ)硒關(guān)系到億萬(wàn)人的健康，開(kāi)發(fā)高硒產(chǎn)品成為必要。湖南省隆回縣是全國(guó)最大的富硒區(qū)之一，產(chǎn)于該地的大豆硒含量大于3.2mg/kg，充分利用隆回富硒大豆這種寶貴資源，對(duì)其深加工及其綜合利用進(jìn)行研究，具有重要的經(jīng)濟(jì)意義。本課題自2008年起開(kāi)始對(duì)冬蟲(chóng)夏草菌絲體發(fā)酵富硒大豆進(jìn)行研究，曾對(duì)冬蟲(chóng)夏草菌絲體發(fā)酵大豆多肽進(jìn)行了初步研究并予以報(bào)道[11]。本實(shí)驗(yàn)以富硒大豆為冬蟲(chóng)夏草菌絲體的培養(yǎng)基進(jìn)行液體發(fā)酵，為開(kāi)發(fā)一種含有富硒大豆和冬蟲(chóng)夏草有效成分的發(fā)酵飲品作一些基礎(chǔ)研究工作。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冬蟲(chóng)夏草(Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc.)菌種，由廣東省微生物研究所微生物菌種保藏中心提供。富硒大豆購(gòu)于湖南隆回北山。

碘塊、溴素、Na2S2O3、甲醇、正已烷等均為分析純；軟脂酸、硬脂酸、亞麻酸、亞油酸、油酸和花生四烯酸標(biāo)準(zhǔn)樣品均為色譜純 Sigma公司。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：C6H12O615g、MgSO40.15g、(NH4)2HPO40.25g、KH2PO40.5g、CaCl20.5g、土豆 200g、麥芽汁120mL、VB150μg、瓊脂20g，加水至1000mL，pH值自然，0.1MPa高壓蒸汽滅菌30min備用。

搖瓶混合發(fā)酵培養(yǎng)基：C6H12O615g、MgSO40.15g、(NH4)2HPO40.25g、KH2PO40.5g、CaCl20.5g、大豆250g(將大豆磨漿，豆水比為1:20)、麥芽汁120mL，加水至1000mL，pH值自然，0.1MPa高壓蒸汽滅菌30min備用。

1.3 儀器與設(shè)備

DV-9100紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京瑞利分析儀器公司；精密pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；P110-Y實(shí)驗(yàn)室超純水器 長(zhǎng)沙源科儀實(shí)驗(yàn)器材有限公司；HZQ-X280恒溫振蕩培養(yǎng)箱 江蘇省太倉(cāng)市華美生化儀器廠；TDL-5Z臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 湖南星科科學(xué)儀器有限公司；GC-8A型氣相色譜儀；TAS-990原子吸收分光光度計(jì)(空氣-乙炔火焰) 北京華陽(yáng)光學(xué)儀器有限公司

1.4 方法

1.4.1 菌種的活化與菌懸液的制備

將冬蟲(chóng)夏草菌種接種到斜面培養(yǎng)基上于26℃恒溫培養(yǎng)7d，然后接種進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，7～10d后用無(wú)菌水洗下孢子，并將其密度調(diào)整為108個(gè)/mL。

1.4.2 搖瓶發(fā)酵與取樣

將菌懸液按接種量體積分?jǐn)?shù)6%接種到200mL發(fā)酵培養(yǎng)基中(500mL三角瓶)，26℃、200r/min條件下進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，分別于0、12、24、36、48、60、72、84、96h取發(fā)酵液樣品進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)重復(fù)3次，每次取兩個(gè)平行樣。數(shù)據(jù)分析采用Excel軟件。

1.4.3 發(fā)酵液脂類(lèi)總量的測(cè)定

索氏抽提法[12]測(cè)定各時(shí)段發(fā)酵液樣品脂類(lèi)物質(zhì)總量。

1.4.4 發(fā)酵液酸價(jià)的測(cè)定

取索氏抽提所得脂肪乙醚溶液30～40mL，以常規(guī)方法測(cè)定酸價(jià)[13]。

1.4.5 發(fā)酵液碘價(jià)的測(cè)定

取索氏抽提所得脂肪乙醚溶液30～40mL，以常規(guī)方法測(cè)定碘價(jià)[14]。

1.4.6 發(fā)酵液游離脂肪酸的測(cè)定[15]

1.4.6.1 提取

將各時(shí)段發(fā)酵液樣品烘干，加石油醚提取3次，合并提取液，向提取液中加Na2CO3溶液萃取3次，合并水相。以HCl調(diào)pH值至3.0，再加入石油醚萃取3次，合并石油醚溶液，減壓濃縮，然后再用KOH為催化劑進(jìn)行甲脂化，用石油醚提取脂肪酸甲酯，氮?dú)獯蹈珊蠹尤胝淹槎ㄈ莺蠊┥V分析。

1.4.6.2 氣相色譜分析游離脂肪酸

色譜柱：不銹鋼填充柱(2m×3mm)，擔(dān)體為洛母沙伯，填充16%的丁二酸二乙二醇酯(DEGS)；溫度：柱溫190℃，汽化室250℃，檢測(cè)器250℃；載氣：高純氮?dú)?，流速?0mL/min；進(jìn)樣量：2μL。

1.4.7 發(fā)酵液硒含量的測(cè)定

1.4.7.1 玻璃器皿的處理

玻璃器皿用5%鉻酸洗液浸泡2 4 h，蒸餾水沖洗，0.5%的硝酸溶液浸泡24h，蒸餾水洗滌干凈后烘干備用。

1.4.7.2 樣品處理

用移液管移取各時(shí)段發(fā)酵液15mL于凱氏燒瓶中，依次緩慢加入15mL濃硝酸和10mL濃硫酸，放入2～5粒玻璃珠防止暴沸，當(dāng)凱氏燒瓶中的溶液顏色呈深棕色時(shí)，及時(shí)加入濃硝酸2～5mL，使凱氏燒瓶中的溶液始終保持棕色或淡棕色，直到有機(jī)物分解完全(不再見(jiàn)棕紅色氧化氮?dú)怏w產(chǎn)生)，繼續(xù)加熱至發(fā)生二氧化硫白色

煙霧，溶液應(yīng)為無(wú)色或微黃色。放冷，加去離子水(保持還原態(tài))，加熱煮沸，除去殘留的硝酸至發(fā)生二氧化硫白色煙霧為止。冷卻后加入去離子水稀釋?zhuān)D(zhuǎn)移到50mL容量瓶中，以少量去離子水多次洗滌凱氏燒瓶，定容，同時(shí)做一空白實(shí)驗(yàn)。

1.4.7.3 Se標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

配制Se標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度系列：0.00、0.05、0.50、1.00、2.50μg/mL。

1.4.7.4 Se含量測(cè)定

按表1所列測(cè)定條件測(cè)定。

表1 原子吸收分光光度計(jì)儀器工作參數(shù)Table 1 Working conditions of FAAS

2 結(jié)果與分析

2.1 脂類(lèi)總量的測(cè)定

表2 各時(shí)段發(fā)酵液脂類(lèi)含量、酸價(jià)、碘價(jià)的變化Table 2 Changes of total lipid content, acid value and iodine value during fermentation

從表2可以看出，在發(fā)酵過(guò)程中脂類(lèi)總量隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)略有減少，由發(fā)酵前的5.45mg/L減少到發(fā)酵48h的4.96mg/L，48h以后發(fā)酵液中脂類(lèi)成分變化不明顯(P＞0.05)。由于富硒大豆?fàn)I養(yǎng)價(jià)值與脂類(lèi)的特點(diǎn)(膽固醇低、脂肪的不飽和程度高)有關(guān)，所以脂類(lèi)減少的幅度小，說(shuō)明發(fā)酵對(duì)富硒大豆的脂類(lèi)保健作用基本沒(méi)有影響。

2.2 不同發(fā)酵時(shí)間發(fā)酵液酸價(jià)的測(cè)定

從表2可以看出，隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)酸價(jià)增加，發(fā)酵48h的酸價(jià)比發(fā)酵前提高了2.8倍(P＜0.05)，游離脂肪酸是冬蟲(chóng)夏草菌絲體水解脂肪的產(chǎn)物。酸價(jià)反映食品中游離脂肪酸的量，游離脂肪酸的增多可以提高脂肪的水溶性[16]，使脂肪更利于人體吸收、利用。

2.3 不同發(fā)酵時(shí)間發(fā)酵液碘價(jià)的測(cè)定

從表2可以看出，隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，碘價(jià)增加，發(fā)酵48h時(shí)的碘價(jià)比發(fā)酵前提高了1.2倍(P＜0.05)。大豆脂肪中不飽和脂肪酸占其脂肪總量的80%左右，大豆脂肪的碘價(jià)比較高。因不飽和脂肪酸具有抗衰老、降低膽固醇等重要作用，富硒大豆發(fā)酵液的碘價(jià)升高說(shuō)明其保健作用進(jìn)一步加強(qiáng)。

2.4 不同發(fā)酵時(shí)間發(fā)酵液游離脂肪酸的檢測(cè)

表3 各時(shí)段發(fā)酵液游離脂肪酸的含量Table 3 Changes of free fatty acids during fermentation

從表3可以看出，隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)游離脂肪酸有增加趨勢(shì)，發(fā)酵48h時(shí)的游離脂肪酸比發(fā)酵前提高了2.8倍，游離脂肪酸增加趨勢(shì)與酸價(jià)表現(xiàn)一致。亞麻酸、亞油酸、油酸、花生四烯酸分別增加5.3、2.9、6.8倍和5.6倍(P＜0.05)。亞麻酸、亞油酸是人體中合成其他不飽和脂肪酸的原料，亞油酸參與磷脂的合成和膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)代謝，亞麻酸可轉(zhuǎn)化為二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸等具有多種重要生理功能的脂肪酸；油酸可降低血脂并與細(xì)胞膜的形成有關(guān)，花生四烯酸是前列腺素的合成前體。富硒大豆發(fā)酵液中游離脂肪酸的增加可增加富硒大豆發(fā)酵液的保健功效。

2.5 不同發(fā)酵時(shí)間發(fā)酵液的Se含量

表4 各時(shí)段發(fā)酵液Se的含量Table 4 Content of selenium during fermentation

按表1儀器工作條件，測(cè)定Se的標(biāo)準(zhǔn)系列液，得出Se元素標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程y=0.0022x-0.0009，相關(guān)系數(shù)為0.99974。從表4可以看出，隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)Se含量基本不變，發(fā)酵對(duì)富硒大豆中的硒基本不會(huì)造成影響。冬蟲(chóng)夏草具有較強(qiáng)的富集礦物質(zhì)的能力，能夠?qū)㈦x子態(tài)礦物質(zhì)轉(zhuǎn)化為生物大分子螯合物來(lái)開(kāi)發(fā)

冬蟲(chóng)夏草有免疫調(diào)節(jié)和高效補(bǔ)充礦物質(zhì)的生物活性強(qiáng)化劑[17]。冬蟲(chóng)夏草或蟲(chóng)草都具有較強(qiáng)的富硒能力，在發(fā)酵培養(yǎng)中發(fā)酵液的硒含量應(yīng)該隨著硒被菌體不斷富集而呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，但實(shí)驗(yàn)中發(fā)酵液的硒含量隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)基本不變，造成這種結(jié)果的原因可能是富硒大豆中的硒主要以有機(jī)硒——富硒蛋白的形式存在。

3 結(jié) 論

冬蟲(chóng)夏草又名“蟲(chóng)草”，為麥角菌科真菌，具有滋補(bǔ)作用和多種藥效，既是一種珍稀的食用菌，又是一種珍貴的中藥材，有較高的保健和藥用價(jià)值。冬蟲(chóng)夏草菌體生產(chǎn)出的保健品“蟲(chóng)草精”、“蟲(chóng)草膠囊”等以全面提高人體免疫力、抗癌、抗衰老等生理功能受消費(fèi)者青睞[18-19]。本實(shí)驗(yàn)中，發(fā)酵液脂類(lèi)總量、游離脂肪酸(包括飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸)含量的變化與冬蟲(chóng)夏草菌絲體的生長(zhǎng)有一定的偶聯(lián)性，發(fā)酵時(shí)間0～48h，冬蟲(chóng)夏草菌絲體的生長(zhǎng)利用富硒大豆中的脂類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行代謝，分解脂類(lèi)物質(zhì)產(chǎn)生游離脂肪酸，導(dǎo)致發(fā)酵液中脂類(lèi)總量隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而減少，由發(fā)酵前的5.45mg/L減少到發(fā)酵48h的4.96mg/L，發(fā)酵48h時(shí)，酸價(jià)增加2.8倍，碘價(jià)增加1.2倍，亞麻酸、亞油酸、油酸、花生四烯酸分別增加5.3、2.9、6.8倍和5.6倍；發(fā)酵48h以后，冬蟲(chóng)夏草菌絲體生長(zhǎng)代謝減慢，發(fā)酵液中脂類(lèi)成分變化不明顯。綜上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，冬蟲(chóng)夏草菌絲體發(fā)酵富硒大豆過(guò)程中，酸價(jià)、碘價(jià)、亞麻酸、亞油酸、油酸、花生四烯酸等變化主要集中在發(fā)酵48h左右，發(fā)酵48h以后發(fā)酵液中脂類(lèi)成分變化不明顯。從生產(chǎn)含有富硒大豆和冬蟲(chóng)夏草有效成分的發(fā)酵飲品工藝角度考慮，發(fā)酵時(shí)間確定為48h較適宜。

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Effect of Liquid-state Fermentation with Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc. on the Contents of Lipids and Selenium in Selenium-rich Soybean

JIANG Sheng-yan，WANG Yao-qiong，ZHAO Liang-zhong*
(Department of Biological and Chemical Engineering, Shaoyang University, Shaoyang 422000, China)

The activated mycelial suspension of Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc. was inoculated into selenium-rich soybean and cultured in a shake flask, and total lipid content, acid value, iodine value, free amino acid composition, selenium content in fermentation broth at different time points during fermentation were measured. The 48 h fermentation broth showed no obvious difference in total lipid content but 2.8-, 1.2-, 5.3-, 2.9-, 6.8-fold and 5.6-fold increases in acid value, iodine value, linolenic acid, linoleic acid,oleic acid, and arachidonic acid, respectively, as compared to the control (unfermented). Similarly, no obvious change in total lipid content was observed during prolonged fermentation. Selenium content in fermentation broth was kept basically unchanged over the entire fermentation period of 96 hours.

Cordyceps sinensis (Berk.)Sacc.；fermentation；selenium-rich soybean；lipids；selenium

TS201.3

A

1002-6630(2010)23-0178-04

2010-09-15

湖南省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2008CK3027)

蔣盛巖(1967—)，男，副教授，碩士，研究方向?yàn)樯锛夹g(shù)。E-mail：jiangsyan2001@163.com

*通信作者：趙良忠(1963—)，男，教授，碩士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：sys169@163.com