一株黃色短桿菌基因工程菌株的構建及其L-纈氨酸積累

徐大慶，譚延振，繆 銘，王小元,*

(1.江南大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2. 河北農業(yè)大學生命科學學院，河北 保定 071001)

一株黃色短桿菌基因工程菌株的構建及其L-纈氨酸積累

徐大慶1,2，譚延振1，繆 銘1，王小元1,*

(1.江南大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2. 河北農業(yè)大學生命科學學院，河北 保定 071001)

從谷氨酸棒桿菌模式菌株C. glutamicum ATCC13032中克隆出L-纈氨酸合成途徑上的限速酶——乙酰羥酸合酶編碼基因ilvBN。對ilvBN進行定點突變，獲得其抗反饋抑制突變型ilvBNr。以大腸桿菌-黃色短桿菌穿梭表達載體pDXW-10為基礎，構建重組質粒pDXW-10-ilvBNr，并轉化野生型黃色短桿菌B. flavum ATCC14067，獲得工程菌株ATCC14067/pDXW-10-ilvBNr。3L罐發(fā)酵實驗結果顯示：在野生型菌株發(fā)酵液中檢測不到L-纈氨酸積累，而工程菌株發(fā)酵液中L-纈氨酸積累達5.0g/L。

乙酰羥酸合酶；抗反饋抑制；黃色短桿菌；發(fā)酵；L-纈氨酸

L-纈氨酸屬于中性氨基酸，與L-異亮氨酸、L-亮氨酸一起稱為支鏈氨基酸，是人體必需的氨基酸之一。L-纈氨酸廣泛應用于醫(yī)藥、食品、飼料、化妝品等領域。工業(yè)上主要是通過應用棒狀桿菌發(fā)酵來生產L-纈氨酸，而選育優(yōu)良的生產菌株是實現L-纈氨酸高效生產的關鍵。自Nakayama等[1]首先于1961年選育了氨基酸缺陷型的L-纈氨酸生產菌以來，人們在棒狀桿菌產L-纈氨酸誘變育種方面進行了大量的研究并取得了顯著的成績[2]。但傳統(tǒng)的誘變育種方式工作量大、周期長，且引起的遺傳變異在染色體上是隨機分配的，一些與氨基酸生物合成無直接關聯的區(qū)域也會被突變，因此可能會對細胞生理產生不可預知的負面效應。代謝工程是在對代謝網絡系統(tǒng)分析的基礎上采用基因工程技術定向改造細胞代謝系統(tǒng)以提高產物得率或改進細胞性能[3]。由于關于谷氨酸棒狀桿菌生理學、生物化學和遺傳學知識的大量累積[4-5]，基于理性設計的代謝工程育種正在成為氨基酸高產菌株選育的主要方式[6]。

雖然國內選育的L-纈氨酸生產菌種較多，但它們均是通過隨機誘變和定向篩選的方法獲得的[2]，其產酸水平有待于進一步提高。另外，傳統(tǒng)誘變育種獲得的L-纈氨酸高產菌株副生雜酸比較多，尤其是副生L-Leu、L-Ileu、L-Met等，這對后提取高純度L-Val

造成很大的困難。過表達生物合成或降解途徑的限速酶是對菌株進行代謝工程改造的主要策略之一。而由ilvBN基因編碼的乙酰羥酸合酶(AHAS)是棒狀桿菌L-纈氨酸合成途徑上的限速酶。本實驗通過定點突變技術獲得AHAS抗反饋抑制突變型編碼基因ilvBNr，然后通過在黃色短桿菌中過表達ilvBNr基因，初步構建過量積累L-纈氨酸的基因工程菌株，并在3L罐發(fā)酵水平上對其產L-纈氨酸能力進行檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質粒和表達載體

大腸桿菌E. coli JM109、谷氨酸棒桿菌模式菌株C. glutamicum ATCC13032、黃色短桿菌野生型菌株B. flavum ATCC14067以及質粒pUC57由本實驗室保藏；E.coli-B. flavum穿梭表達載體pDXW-10，大小為8351bp，是由本實驗室構建的適合于棒狀桿菌代謝工程研究的組成型表達載體[7]。

1.1.2 試劑

限制性內切酶、T4 DNA 連接酶、DNA Marker、ATP、質粒小量制備試劑盒 上海生工生物工程服務有限公司； PrimeSTAR HS DNA聚合酶 大連寶生物公司；引物合成及測序由上海生工生物工程服務有限公司完成；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、基因組提取試劑盒 北京天根生化科技有限公司；酵母粉、胰蛋白胨Oxoid公司；其他生化試劑均為國產或進口分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

大腸桿菌LB培養(yǎng)基參照文獻[8]配制；黃色短桿菌斜面培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基+0.5%葡萄糖；黃色短桿菌種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 25、尿素 1.25、玉米漿 20、KH2PO41、MgSO45，pH 7.0；黃色短桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖150、(NH4)2SO435、玉米漿20、KH2PO41、MgSO41。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取和純化

DNA的提取和純化均按相應試劑盒說明書進行。DNA片段的酶切和連接以及大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備及轉化等操作均按文獻[8]方法進行；黃色短桿菌感受態(tài)的制備和轉化按文獻[9]方法進行。

1.2.2 PCR擴增野生型ilvBN基因

依據谷氨酸棒桿菌C. glutamicum ATCC13032 ilvBN基因序列[10]，設計正向引物ilvBN-F(5＇- actagaattcgaaagg acatgaacgatgaatgtggcagcttctcaac-3＇，下劃線部分為引入EcoRI位點)和反向引物ilvBN-R(5＇- actaaagcttttagatc ttggccggagccatggtcttcg-3＇，下劃線部分為引入HindIII位點)。以C. glutamicum ATCC13032基因組DNA為模板，ilvBN-F和ilvBN-R 為引物擴增ilvBN。反應體系為50μL，包括10μL 5×Primer STAR buffer (Mg2+plus)，4μL dNTP 混合物(各2.5mmol/L)，1μL基因組模板，1μL正向引物ilvBN-F(20μmol/L)，1μL反向引物ilvBN-R(20 μmol/L)，0.5μL Prime STAR HS DNA Polymerase。 PCR反應條件為：94℃預變性5min；然后在以下條件下進行35 輪循環(huán)：94℃變性30s，60℃退火15s，72℃延伸2.5min；最后一個循環(huán)完成后72℃再延伸10min；4℃保存。擴增產物為2428bp。

1.2.3 ilvBN基因的定點突變

將野生型基因ilvBN的 PCR產物用EcoRI和HindIII雙酶切，連接到同樣用EcoRI和HindIII雙酶切的克隆載體pUC-57上，構建成重組質粒pUC57-ilvBN。以pUC57-ilvBN為模板，使用攜帶突變位點的一對完全互補的引物p-F(5＇-g t t c a g g a c g t a g a c g A T G A c Ttttcccgcgtatcagg-3＇)和p-R(5＇-cctgatacgcgggaaa AgTCATcgtctacgtcctgaac-3＇)，其中大寫堿基為引入的突變位點，將ilvN上編碼別構中心上3個氨基酸Gly-Ile-Ile的核苷酸ggaatcatt定點突變成gatgacttt(編碼Asp-Asp-Phe)。對質粒進行PCR擴增。反應體系為50μL，包括10μL 5×Primer STAR buffer (Mg2+plus)，4μL dNTP混合物(各2.5mmol/L)，4μL質粒pUC57-ilvBN(100ng/μL)模板，1μL正向引物p-F(20μmol/L)，1μL反向引物p-R (20μmol/L)，0.5μL Prime STAR HS DNA Polymerase。反應程序：94℃預變性5min；然后在以下條件下進行30 輪循環(huán)：94℃變性30s，60℃退火15s，72℃延伸5.5min；72℃再延伸10min；10℃保存。擴增產物直接用1μL DpnI內切酶37℃消化1h。取20μL消化產物轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞。挑選轉化子，擴繁培養(yǎng)，提取質粒，測序，突變的重組質粒命名為pUC57-ilvBNr。

1.2.4 重組質粒pDXW-10-ilvBNr的構建及轉化

以質粒pUC57-ilvBNrDNA為模板，擴增突變型基因ilvBNr，擴增引物及條件同1.2.2節(jié)。將ilvBNr和ilvBN PCR產物分別用EcoRI和HindIII雙酶切，分別連接到同樣用EcoRI和HindIII雙酶切的E. coli-B. flavum穿梭表達載體pDXW-10上，構建的重組質粒大小都為10717 bp，分別命名為pDXW-10-ilvBNr和pDXW-10-ilvBN。重組質粒分別轉化黃色短桿菌B. flavum ATCC14067，構建成工程菌株ATCC14067/pDXW-10-ilvBNr和ATCC14067/pDXW-10-ilvBN。

1.2.5 工程菌株ATCC14067/pDXW-10-ilvBNr的3L罐發(fā)酵

種子液培養(yǎng)：挑一滿環(huán)新鮮斜面上的菌體接種至種子培養(yǎng)基，在30℃、250r/min條件下培養(yǎng)至對數生長中后期。

上罐發(fā)酵：按10%接種量將種子液0.12L接入3L發(fā)酵罐中，初始裝液量1.2L。通風量200L/h，攪拌轉速控制范圍為200～950r/min，培養(yǎng)溫度30℃。溶氧通過攪拌自動控制在設定值。菌體生長初期及對數生長期溶氧控制在50%，穩(wěn)定期溶氧控制在30%。流加25% 氨水和2mol/L HCl 以控制pH7.0。每隔2h取樣測菌濃度及殘?zhí)?，根據耗糖速率確定補料量，通過流加質量濃度為80g/100mL的葡萄糖使菌體在進入衰亡期之前糖質量濃度維持在10～15g/L。以ATCC14067/pDXW-10-ilvBN和B.flavum ATCC14067為對照菌株。

1.2.6 菌濃度測定

吸取0.1mL的發(fā)酵液，用蒸餾水適當稀釋，采用紫外分光光度計測定562nm 波長處的吸光度。

1.2.7 殘?zhí)菧y定

采用DNS法[11]。

1.2.8 氨基酸含量測定

采用高效液相色譜系統(tǒng)(HPLC)自動柱前衍生化法測定。采用Agilent公司1200 series色譜儀。色譜柱：Agilent Eclipse-AAA 柱。流動相水相(1L)：4.52g 無水乙酸鈉、200μL 三乙胺、5mL 四氫呋喃、pH7.2；有機相(1L)：4.52g 無水乙酸鈉、400mL 甲醇、400mL 乙腈。色譜條件：柱溫40℃，流速1.0mL/min，DAD 檢測器。

2 結果與分析

2.1 ilvBN基因的PCR擴增及定點突變

為了獲得解除反饋抑制的AHAS[12]，實驗從谷氨酸棒桿菌模式菌株C. glutamicum ATCC13032基因組上成功地擴增出野生型ilvBN，然后通過定點突變技術將ilvN上編碼別構中心上3個氨基酸Gly-Ile-Ile的核苷酸ggaatcatt定點突變成gatgacttt(編碼Asp-Asp-Phe)(圖1)，成功獲得了抗反饋抑制的突變型基因ilvBNr。

圖1 ilvBNr基因定點突變位點及其上下游序列測序圖譜Fig.1 Sequencing map showing the site-directed mutagenesis ofilvBNr

2.2 重組質粒ATCC14067/pDXW-10-ilvBN和pDXW-10-ilvBNr的構建及轉化黃色短桿菌

黃色短桿菌是工業(yè)上用來發(fā)酵生產L-纈氨酸的主要菌種之一。通過16S rDNA雜交分析，發(fā)現土壤棒桿菌的兩個代表種C. glutamicum與B. flavum親緣關系非常近[13]。筆者將解除反饋抑制的突變型基因ilvBNr異源轉化黃色短桿菌B. flavum ATCC14067。ilvBNr的PCR產物用EcoRI和HindIII 雙酶切，并連接到同樣用EcoRI和HindIII 雙酶切的E. coli-B. flavum穿梭表達載體pDXW-10上，連接產物轉化大腸桿菌JM109，挑選卡那霉素抗性轉化子，提取重組質粒。以重組質粒為模板，ilvBN-F和ilvBN-R 為引物擴增ilvBNr，擴增產物大小為2.4kb，與理論值一致(圖2，泳道2)；用EcoRI單酶切重組質粒，獲得大小為10.7kb片段，與理論值一致(圖2，泳道3)。通過單酶切及PCR驗證，說明重組質粒構建成功。重組質粒pDXW-10-ilvBNr電轉化黃色短桿菌，對得到的轉化子中的質粒進行酶切鑒定，片段大小為10.7 kb，說明重組質粒轉化成功，獲得工程菌株ATCC14067/ pDXW-10-ilvBNr。同樣方法，成功獲得對照工程菌株ATCC14067/pDXW-10-ilvBN。

圖2 重組質粒pDXW-10-ilvBNr構建結果及其驗證Fig.2 Physical map and single enzymatic digestion based identification of recombinant plasmid pDXW-10-ilvBNr

2.3 工程菌ATCC14067/pDXW-10-ilvBNr3L罐發(fā)酵水平的L-纈氨酸積累

為了檢測工程菌ATCC14067/pDXW-10-ilvBNr產L-纈氨酸的情況，進行了3L罐發(fā)酵實驗。當發(fā)酵時間到達68h后，菌體進入衰亡期。選取72h停止發(fā)酵，通過HPLC方法檢測發(fā)酵液中各種氨基酸的含量。結果顯示：在野生型菌株B. flavum ATCC14067發(fā)酵液中未檢測到L-纈氨酸，工程菌株ATCC14067/pDXW-10-ilvBN發(fā)酵液中L-纈氨酸產量為2.85g/L，而工程菌株ATCC14067/ pDXW-10-ilvBNr發(fā)酵液中目的產物L-纈氨酸產量達到5.0g/L；另外，相比野生型菌株，工程菌株ATCC14067/ pDXW-10-ilvBN和ATCC14067/pDXW-10-ilvBNr發(fā)酵液中L-丙氨酸含量都顯著降低，L-異亮氨酸和L-亮氨酸含量顯著提高(表1)；其他氨基酸含量無顯著變化(數據未顯示)。

表1 發(fā)酵液中L-纈氨酸及其代謝相關氨基酸含量Table 1 Concentrations ofL-valine and its metabolism-related amino acids in fermentation broth of differentB. flavumstrains

3 討 論

3種支鏈氨基酸：L-纈氨酸、L-異亮氨酸和L-亮氨酸的生物合成途徑是緊密聯系的，在棒狀桿菌中它們都以圖3的方式進行生物合成。異亮氨酸和纈氨酸是由相同酶催化的兩條平行的合成途徑合成的，而亮氨酸和纈氨酸共用同一前體，是由纈氨酸合成途徑中的一條分支反應所合成。 L-纈氨酸是以丙酮酸為底物，通過四步反應轉化而成。四步反應依次分別由ilvBN基因編碼的乙酰羥酸合酶、ilvC基因編碼的乙酰羥酸異構還原酶、ilvD基因編碼的二羥酸脫氫酶和ilvE基因編碼的轉氨酶催化[14]。而由ilvBN基因編碼的AHAS是L-纈氨酸合成途徑上的第一個酶，是限速酶。C. glutamicum的AHAS全酶由兩個ilvB基因編碼的大亞基(催化亞基)和兩個ilvN基因編碼的小亞基(調節(jié)亞基)構成。Eggeling等[15]研究發(fā)現：3種支鏈氨基酸都存在的情況下，對AHAS的最大抑制率約為50%。Elisakova等[12]研究結果表明：L-纈氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸在AHAS上的結合位點為同一位點，位于小亞基N上。3種支鏈氨基都可以對AHAS進行單獨的反饋抑制作用。將AHAS小亞基別構中心的3個氨基酸Gly-Ile-Ile(20～22位)定點突變成相應的Asp-Asp-Phe，能夠完全解除3種支鏈氨基酸對AHAS的反饋抑制作用。本實驗獲得了一株過量積累L-纈氨酸的黃色短桿菌基因工程菌株ATCC14067/ pDXW-10-ilvBNr，其產量的提高是通過異源過表達谷氨酸棒桿菌ilvBN基因的抗反饋突變型實現的。在野生型菌株中，AHAS除在活性水平上受反饋抑制外，在合成水平還受到其3個末端產物：L-纈氨酸、L-異亮氨酸和L-亮氨酸的多價阻遏[16]，使其不能有效積累L-纈氨酸。在工程菌株ATCC14067/pDXW-10-ilvBN中，使用組成型表達載體pDXW-10表達野生型ilvBN，解除了AHAS合成水平的多價阻遏作用，使其能大量積累L-纈氨酸。而在工程菌株ATCC14067/pDXW-10-ilvBNr中，同時解除了AHAS合成水平的多價阻遏作用及活性水平的反饋抑制作用，使其L-纈氨酸的積累能力進一步大幅度提高。

圖3 谷氨酸棒桿菌中與L-纈氨酸生物合成相關的代謝途徑Fig.3 Metabolic pathways related toL-valine biosynthesis inC. glutamicum

在本實驗中發(fā)現，工程菌株發(fā)酵液中除了L-纈氨酸產量大幅度提高外，L-丙氨酸含量顯著降低，這可能是由于過表達抗反饋抑制的AHAS使更多的丙酮酸用于L-纈氨酸的生物合成，進而減少了用于L-丙氨酸轉化的丙酮酸的量造成的。可見，在工程菌株中，丙酮酸的供給是相對不足的，增加前體物質丙酮酸供給是提高L-纈氨酸產量的另一關鍵。另外，工程菌發(fā)酵液中L-異亮氨酸和L-亮氨酸含量也都有顯著提高，這表明由過表達AHAS而增加的碳流一部分被用于L-異亮氨酸和L-亮氨酸的過量合成。因此，在本實驗的基礎上，為了最終獲得高產L-纈氨酸的基因工程菌株，后期的代謝工程改造工作可以從如下兩個大的方面開展研究： 1)通過基因工程技術降低丙酮酸到乙酰CoA的代謝流，使糖酵解的終產物丙酮酸大量積累，為L-纈氨酸的生物合成提供充足的底物。乙酰CoA合成量的減少而影響到菌體生長，可以通過在培養(yǎng)基中添加乙酸鈉來解決[17]；2)降

低蘇氨酸到2-酮丁酸的代謝流以減少L-異亮氨酸的合成，降低2-酮異戊酸到2-異丙基蘋果酸及酮泛解酸的代謝流以減少L-亮氨酸及D-泛酸的合成，降低丙酮酸到L-丙氨酸的代謝流以減少L-丙氨酸的合成，這些都能使更多的碳流用于L-纈氨酸的生物合成。

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Construction and L-valine Accumulation of a Genetic Engineering Brevibacterium flavum Strain

XU Da-qing1,2， TAN Yan-zhen1， MIAO Ming1， WANG Xiao-yuan1,*
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China；2. College of Life Sciences, Agricultural University of Hebei, Baoding 071001, China)

As a rate-limiting enzyme for L-valine biosynthesis, the ilvBN gene encoding acetyl-carboxylic acid synthase (AHAS) from Corynebacterium glutamicum ATCC13032 was amplified by PCR, followed by site-direct mutagenesis to obtain an ilvBNrgene, the anti-feedback inhibition gene of ilvBN. The ilvBNrgene inserted into E. coli-Brevibacterium flavum shuttle expression vector pDXW-10 to construct a recombinant plasmid pDXW-10-ilvBNr, which was subsequently transformed into B. flavum ATCC14067, producing a genetic engineering strain ATCC14067/pDXW-10-ilvBNr. The fermentation experiments conducted in a 3 L fermentor showed that no L-valine accumulation was detected in the fermentation broth of the original strain, while an L-valine accumulation of 5.0 g/L was observed in the fermentation broth of the constructed engineering strain.

acetyl-carboxylic acid synthase；anti-feedback inhibition；Brevibacterium flavum；fermentation；L-valine

Q851

A

1002-6630(2010)23-0262-05

2010-04-15

國家“863”計劃項目(2007AA02Z229；2007AA02Z230)

徐大慶(1972—)，男，博士研究生，研究方向為微生物代謝工程。E-mail：daqingxu@yahoo.com.cn

*通信作者：王小元(1964—)，男，教授，博士，研究方向為食品安全及微生物代謝工程。E-mail：xiaoyuanwang@hotmail.com