光皮木瓜綠原酸的提取及抗菌活性測定

胡仲秋，洪小迪，岳田利

(西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100)

光皮木瓜綠原酸的提取及抗菌活性測定

胡仲秋，洪小迪，岳田利

(西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100)

為提高木瓜的利用價值，首次利用甲醇研究光皮木瓜中綠原酸的最佳提取工藝，在單因素試驗基礎上，通過正交試驗設計考察浸提溶劑體積分數、浸提溫度、浸提料液比和浸提時間對綠原酸提取的影響，并初步考察綠原酸樣品液對志賀氏痢疾桿菌及金黃色葡萄球菌的抗菌活性。結果表明從木瓜中提取綠原酸的最佳工藝條件為：以85%甲醇溶液(85:15，V/V)浸提木瓜粉、浸提料液比1:30(g/mL)、浸提溫度40℃、浸提時間14h。在該工藝條件下，綠原酸的最高產率可達到0.142%。綠原酸提取液對志賀氏痢疾桿菌和金黃色葡萄球菌具有明顯的抗菌活性，表明民間所用的木瓜白酒浸泡液的主要藥理活性成分可能為綠原酸。

光皮木瓜；綠原酸；提取優化；抗菌活性；志賀氏痢疾桿菌；金黃色葡萄球菌

綠原酸(chlorogenic acid)是許多食用植物及藥用植物中抗菌消炎、清熱解毒的重要活性成分[1-4]，有研究認為，綠原酸是很有希望的抗艾滋病毒(HIV)的先導化合物[5]，它具有清除自由基[6-7]、抗脂質過氧化[8]和抗菌抗病毒等作用[9-10]。國內外一些學者從植物中提取多酚(綠原酸作為多酚中的一個組分)，并考察了綠原酸的活性[11-12]。然而，很少有人從資源豐富的木瓜中提取綠原酸并研究其活性。木瓜為薔薇科植物貼梗海棠[Chaenomeles speciosa (Sweet) Nakai]的成熟果實，有平肝和胃、去濕舒筋的功效，常用于治療腰酸腿痛、風濕性關節炎、四肢轉筋、吐瀉等癥[13-14]。在民間醫術中，木瓜常用水或酒精浸泡，飲用后可以治腹瀉和腫脹。木瓜在我國廣泛種植，為我國特有古老果樹之一，而且產量極大，僅云南省木瓜年產量就達5×106kg，現在山東、河南、陜西、安徽、江蘇、湖北、四川、浙江、江西、廣東、廣西等省(區)都有栽培。本實驗基于我國豐富的木瓜資源，研究光皮木瓜中綠原酸的甲醇提取法及其最佳工藝，并根據民間用木瓜白酒浸泡液治療腹瀉和腫脹，初步考察綠原酸對志賀氏痢疾桿菌及金黃色葡萄球菌的抗菌活性。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

鮮光皮木瓜(干燥后制成粉狀)，采于西北農林科技大學；綠原酸標準品 中國藥品生物制品檢定所；金黃色葡萄球菌CVM14、志賀氏桿菌CMCC56由西北農林科技大學食品微生物安全試驗室楊保偉博士恵贈。

甲醇(分析純)；正己烷、氯仿(均為分析純)；蒸餾水；甲醇(色譜純) 美國Fisher公司。

MP200B電子天平 上海精科天平儀器廠；電熱恒溫水浴鍋 楊凌天成公司；SHB-III循環水式多用真空泵鄭州長城科工貿有限公司；旋轉蒸發儀 瑞士Buchi公司；PK121R離心機 意大利ALC公司；UV mini 1240紫外分光光度計和Lc2010型高壓液相色譜儀 日本Shimadzu公司；PL202-S精密電子天平 瑞士梅特勒-托利多公司；CNP-9080隔水式恒溫培養箱 上海精宏實驗設備有限責任公司；ClassⅡ生物安全柜 美國 Nuaire公司。

1.2 木瓜中綠原酸的甲醇提取工藝以及工藝優化方法

1.2.1 提取工藝

工藝流程：200g干燥的木瓜片→粉碎成粉狀(60目過篩)→加入甲醇浸提(2000mL)→抽濾→旋轉蒸發(60℃旋轉至100mL)→冷凍干燥得51.3g固體→取7g加入150mL蒸餾水充分溶解→加入100mL正己烷萃取→加入100mL氯仿→濾紙過濾→通過0.22μm水系濾膜過濾→獲得濾液80mL→旋轉蒸發(60℃旋轉至50mL)→冷凍干燥得2.0g綠原酸粗品。

檢測步驟：取2.0g綠原酸粗品和綠原酸標準品0.020g分別于100mL的容量瓶中用蒸餾水溶解并定溶，即得到樣品液和0.2g/L綠原酸標準溶液。標準液稀釋10倍后為0.02g/L的綠原酸標準溶液。樣品液和0.02g/L標準溶液分別通過0.45μm水系濾膜過濾，分別上高壓液相色譜儀進行檢測。流動相為甲醇-水(3:7，V/V)，流速0.8mL/min，紫外檢測器檢測波長設定為329nm，用Dikma HPLC反相C18柱(250mm×46mm，5μm)分離，確證提取液中是否含有綠原酸。

1.2.2 光皮木瓜綠原酸提取的單因素試驗

采用1.2.1節提取工藝，用紫外-可見分光光度計檢測綠原酸含量。

1.2.2.1 甲醇溶液的選擇

精確稱取5.00g木瓜粉，分別用體積分數50%、70%、90%、100%甲醇溶液100mL作為浸提劑， 40℃水浴浸提12h。按照1.2.2節方法進行操作。

1.2.2.2 浸提時間的選擇

精確稱取5.00g木瓜粉，用100mL 70%甲醇溶液作為浸提劑，分別在40℃水浴下浸提8、12、24、36h，按照1.2.2節方法進行操作。

1.2.2.3 浸提溫度的選擇

精確稱取5.00g木瓜粉，用100mL 70%甲醇溶液作為浸提劑，分別在30、40、50、60℃水浴下浸提12h，按照1.2.2節方法進行操作。

1.2.2.4 料液比的選擇

按照浸提料液比為1:10、1:20、1:30、1:40(g/mL)精確稱取10.00、5.00、3.33、2.50g木瓜粉，用100mL 70%甲醇溶液作為浸提劑，在40℃水浴下浸提12h，按照1.2.2節方法進行操作。

1.2.3 木瓜中綠原酸的甲醇提取法正交試驗

將甲醇溶液體積分數、浸提時間、浸提溫度、浸提料液比4個因素，分別設計3個不同水平，選擇L9(34)正交試驗表(表1)，按照1.2.2節方法進行試驗。

表1 甲醇提取法提取木瓜中綠原酸因素水平表Table 1 Factors and levels for extracting chlorogenic acid from Chaenomeles sinensis Koehne

1.2.4 正交試驗預期最佳組合驗證實驗

從正交試驗中得到的最佳組合如果沒有在正交試驗表中，則進行驗證實驗。

1.2.5 光皮木瓜甲醇提取物中綠原酸的檢測

粗提物中綠原酸的確證采用HPLC方法檢測，后續結果均采用紫外分光光度計法檢測。

1.2.5.1 綠原酸標準品紫外分光光度法檢測波長的掃描

精確稱取綠原酸標準品0.020g，用無水甲醇溶解，定容于100mL容量瓶中，在紫外分光光度計上從310～400nm對標準溶液進行波長掃描，獲得標準品稀釋液的紫外吸收光譜曲線。

1.2.5.2 綠原酸標準品標準曲線的制作

精確稱取綠原酸標準品20mg，用100mL無水甲醇溶解配制為200μg/mL的綠原酸標準溶液，吸取一定體積的200μg/mL綠原酸標準溶液分別制作成質量濃度1.0、3.0、5.0、7.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0μg/mL的梯度溶液，用無水甲醇作參比液，在紫外分光光度計上于329nm波長處分別測量各自的吸光度，繪制標準曲線。

1.2.6 光皮木瓜綠原酸提取產率的計算

將木瓜綠原酸提取樣品溶液稀釋100倍，分別于329nm處檢測其吸光度，根據其吸光度在標準曲線上查得綠原酸含量。所有實驗平行3次，數值為3次實驗平均值。光皮木瓜綠原酸提取產率按下式計算:

式中：V為稀釋100倍濾液中綠原酸的含量/(μg/mL)；C為過濾后的體積/mL；m為木瓜粉的質量/g。

1.2.7 抗菌活性實驗

使用瓊脂擴散法進行抗菌實驗[16]。細菌細胞菌懸液經24h培養將濃度調整到1×108CFU/mL。將滅菌營養瓊脂倒入滅菌平板中，待瓊脂凝固后以每20mL瓊脂加200μL細菌菌懸液的比例加入調整好濃度的細菌菌懸液，并使其分布均勻。用滅菌的打孔器在平板中均勻地打孔。在孔穴中或不銹鋼圈中加入70μL綠原酸提取液，用與綠原酸提取液相同濃度的青霉素作為陽性對照，用空白樣做陰性對照。每個實驗重復1次。

1.2.8 數據處理

所有數據采用DPS數據處理軟件(V2.000)處理和分析(α=0.01)。

2 結果與分析

2.1 綠原酸最大吸收波長的掃描

圖1 2μg/mL綠原酸標準品溶液(無水甲醇作為溶劑)的紫外光譜掃描圖譜Fig.1 Ultraviolet absorption spectrum of chlorogenic acid standard solution (2μg/mL in anhydrous methanol)

實驗發現以200μg/mL綠原酸標準溶液稀釋100倍(2 μg/mL)后的掃描圖譜最好。即從圖1可看出，綠原酸的最大吸收峰都在329nm(峰4)，即選取329nm為HPLC和紫外分光光度法檢測綠原酸的檢測光波長。

2.2 光皮木瓜甲醇粗提物中綠原酸的HPLC檢測結果

由圖2可以看出，木瓜綠原酸提取純化液的HPLC圖譜中峰2與綠原酸標品溶液的峰1重合，而且綠原酸是提取物中的一個主要成分。

圖2 綠原酸樣品液和0.02g/L綠原酸標品溶液HPLC圖譜的比對Fig.2 HPLC chromatograms chlorogenic acid sample solution and 0.02 g/L of chlorogenic acid standard solution

2.3 綠原酸標準品標準曲線

用200μg/mL的綠原酸標準液溶液制作質量濃度分別為0.0、1.0、3.0、5.0、7.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0μg/mL的溶液，利用紫外分光光度計在329nm波長處測出各自的吸光度繪制出標準曲線如圖3所示：y = 0.0562x-0.009(R2= 0.9992)。

圖3 綠原酸標準品溶液(無水甲醇作為溶劑)的標準曲線Fig.3 Standard curve of chlorogenic acid standard solution (anhydrous methanol as solvent)

2.4 木瓜中綠原酸的甲醇提取法單因素試驗

2.4.1 甲醇溶液(浸提劑)體積分數對綠原酸產率的影響

圖4 不同甲醇溶液(浸提劑)中甲醇體積分數對綠原酸產率的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on the yield of chlorogenic acid

從圖4可以看出，用甲醇溶液作為浸提劑時甲醇體積分數分別是50%、70%、90%時，綠原酸產率呈逐漸上升趨勢，當90%甲醇作提取溶劑時綠原酸產率達到最大，甲醇體積分數為90%～100%時綠原酸產率迅速減小。方差分析顯示在1%差異水平下，90%甲醇作為浸提溶劑時與100%甲醇作為浸提溶劑時綠原酸產率的差異是極顯著的，說明甲醇體積分數在70%～90%之間為提取綠原酸的最佳區域。所以做正交試驗時甲醇體積分數的3個水平分別選取為80%、85%、90%。

2.4.2 浸提時間對綠原酸提取的影響

圖5 浸提時間對綠原酸產率的影響Fig.5 Effect of extraction time on the yield of chlorogenic acid

從圖5可看出，浸提時間從8～12h綠原酸產率迅速提高，12h達到最高，12h后開始逐漸降低，24h次之，36h綠原酸產率最低。方差分析顯示，在1%差異水平下，8h浸提的產率與其他各水平的產率呈極顯著性差異。浸提時間12、24h和36h各水平之間，綠原酸產率的差異都是極不顯著的。從提高綠原酸的效率角度考慮，選取正交試驗該因素的不同水平選在12h左右為宜。故做正交試驗時，浸提時間這個因素的3個水平分別選取為10、12、14h。

2.4.3 浸提溫度對綠原酸產率的影響

圖6 浸提溫度對綠原酸產率的影響Fig.6 Effect of extraction temperatures on the yield of chlorogenic acid

從圖6可看出，浸提溫度分別設定為30、40、50、60℃時，綠原酸產率呈現先增高后減小趨勢。30℃到40℃為上升階段，40℃時最大，從40℃到50℃迅速降低，而50℃到60℃緩慢下降。說明在40℃以下時隨溫度的增加產率增加，但當溫度超過40℃時，溫度再升高產率不僅沒有增加，反而導致產率下降，這與時間因素的現象一致。方差分析顯示，在1%差異水平下，50℃和60℃與40℃和30℃水平之間綠原酸產率的差異都極顯著。因此為了提高提取綠原酸的效率，在40℃左右為最佳，所以正交試驗時浸提溫度的3個水平分別選取35、40、45℃。

2.4.4 料液比對綠原酸產率的影響

圖7 液料比對綠原酸產率的影響Fig.7 Effect of liquid-to-solid ratio on the yield of chlorogenic acid

從圖7可看出，料液比從1:10減小到1:20時綠原酸產率迅速增加，料液比從1:20減小到1:30時其產率緩慢增加，料液比在1:30到1:40時其產率緩慢下降。說明當料液比達到一定的比例但卻未達到飽和綠原酸溶解度時，綠原酸的產率隨料液比的減小而增大，料液比在1:30和1:40之間可能是綠原酸在木瓜粉細胞內外的溶解平衡區。方差分析顯示，在1%差異水平下，料液比1:30、1:40、1:20各水平間的綠原酸產率的差異是極不顯著的；料液比1:10與其他各水平之間的綠原酸產率的差異都是很顯著的。因此為了提高提取綠原酸的效率、節省提取劑，做正交試驗時料液比的3個水平分別選取為1:25、1:30、1:35。

2.5 木瓜中綠原酸的甲醇提取法正交試驗

2.5.1 木瓜中綠原酸甲醇提取法正交試驗極差分析

表2 甲醇提取木瓜中綠原酸產率L9(34)正交試驗設計及結果Table 2 Results and analysis of the orthogonal test

由表2中各因素極差R值可知，影響木瓜中綠原酸產率的因素主次順序為：C＞B＞A＞D，即浸提料液比＞甲醇體積分數＞浸提時間＞浸提溫度。由正交試驗極差分析還可知，其最佳組合條件為A3B2C2D2，即浸提時間14h、甲醇體積分數85%、浸提料液比1:30、浸提溫度40℃。

2.5.2 木瓜中綠原酸甲醇提取法正交試驗方差分析

對木瓜中綠原酸提取正交試驗的方差分析結果，采用新復極差法進行方差分析(表3)。

表3 甲醇提取木瓜中綠原酸產率正交試驗方差分析結果Table 3 Analysis of variance

表3以D因素(影響最小)來估計其他各因素的F值，從表3結果可看出，其他因素F值均小于Fα，即4個因素影響都不顯著，這說明各因素水平取值在最佳范圍。從表3還可以看出，影響木瓜中綠原酸產率因素主次順序為C＞B＞A，即浸提料液比＞甲醇體積分數＞浸提時間，這與2.5.1節中的極差分析結果相一致。

2.5.3 預期最佳組合的驗證實驗結果

由于最佳組合試驗并沒有在正交表中，所以按照最佳的試驗組合A3B2C2D2進行驗證實驗，結果所測得的產率為(0.142±0.006)%，高于正交試驗9個試驗組合中任一個產率值，說明正交試驗結果可靠。

2.5.4 抗菌活性檢測結果

經初步純化的綠原酸樣品液對金黃色葡萄球菌的抗菌試驗結果如圖8A所示，對志賀氏痢疾桿菌的抗菌試驗結果如圖8B所示。

從圖8A可以看出，綠原酸樣品液對金黃色葡萄球菌具有明顯的抗菌活性，而且隨劑量的增大抗性增強。當綠原酸質量濃度從0.49×10-3g/mL增大到0.71×10-3g/mL時，抑菌圈從(12.0±0.3)mm增大到(16.2±0.2)mm。從圖8B可以看出，綠原酸樣品液對志賀氏痢疾桿菌也具有明顯的抗菌活性，當綠原酸質量濃度為0.49×10-3g/ mL時，抑菌圈直徑為(12.3±0.1)mm，表現出對志賀氏痢疾桿菌與對金黃色葡萄球菌相當的抗性。這個結果表明，民間使用木瓜白酒浸泡液對冶療腹瀉和腫脹的機理是因為其中含有主要活性成分綠原酸。面對當前病原菌對抗生素類藥物產生了普遍的耐藥性[15-16]，利用我國豐富的木瓜資源開發出抗菌新藥，這無疑具有廣闊的前景。

圖8 綠原酸樣品液的抗菌活性檢測結果Fig.8 Antibacterial activities of chlorogenic acid sample solution against Staphylococcus aureus and Shigella dysenteria

3 結 論

3.1 本實驗首次從光皮木瓜中提取出綠原酸，通過數據分析可知，甲醇提取法在試驗范圍內各因素對綠原酸產率影響作用的大小依次為浸提料液比＞甲醇體積分數＞浸提時間＞浸提溫度。

3.2 甲醇提取法提取木瓜中綠原酸的最佳工藝參數是：以體積分數85%甲醇溶液為浸提溶劑，以浸提料液比1:30(g/mL)在40℃浸提14h后得到綠原酸的最高產率為0.142%。

3.3 綠原酸樣品液對引起炎癥的金黃色葡萄球菌和對引起腹瀉的志賀氏痢疾桿菌具有明顯的抗性。該結果表明民間木瓜白酒浸泡液的主要藥理活性成分為綠原酸。

[1]VIVIANE M, ADRIANA F. Chlorogenic acids and related compounds in medicinal plants and infusions[J]. Food Chemistry, 2009, 113: 1370-1376.

[2]ZHANG Lunyi, COSMA G, GARDNER H, et al. Effect of chlorogenic acid on hydroxyl radical[J]. Mol Cell Biochem 2003, 247: 205-210.

[3]NARDINI M, CIRILLO E, NATELLA F, et al. Absorption of phenolic acids in humans after coffee consumption[J]. J Agric Food Chem, 2002, 50: 5735-5741.

[4]ZHAO Zhaohui, SHIN HS, SATSU H, et al. 5-Caffeoylquinic acid and caffeic acid down-regulate the oxidative stress- and TNF-α-induced secretion of interleukin-8 from Caco-2 cells[J]. J Agric Food Chem, 2008, 56: 3863-3868.

[5]YANG B, MENG Z Y, YAN L P, et al. Pharmacokinetics and metabolism of 1,5-dicaffeoylquinic acid in rats following a single intravenous administration[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2006, 40: 417-422.

[6]FEDERICA P, STEFANIA B, LARA M, et al. Analysis of phenolic compounds and radical scavenging activity of Echinacea spp.[J]. Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2004, 35: 289-301.

[7]DONATA B, MICHAEL M, WERNER P, et al. Detection and activity evaluation of radical scavenging compounds by using DPPH free radical and on-line HPLC-DPPH methods[J]. Eur Food Res Technol, 2002, 214: 143-147.

[8]LI Shuyuan, CHANG Cuiqing, MA Fuying, et al. Modulating effects of chlorogenic acid on lipids and glucose metabolism and expression of hepatic peroxisome proliferator-activated receptor-α in golden hamsters fed on high fat diet[J]. Biomedical and Environmental Sciences, 2009, 22: 122-129.

[9]FARAH A, DONANGELO C M. Phenolic compounds in coffee[J]. Brazilian Journal of Plant Physiology, 2006, 18: 23-36.

[10]WANG Guifeng, SHI Liping, REN Yudan, et al. Anti-hepatitis B virus activity of chlorogenic acid, quinic acid and caffeic acid in vivo and in vitro[J]. Antiviral Research, 2009, 83: 186-190.

[11]CLIFFORD W B, MAMDOUH M A, ADRIENNE L E K, et al. A flavanone and two phenolic acids from Chrysanthemum morifolium with phytotoxic and insect growth regulating activity[J]. Journal of Chemical Ecology, 2004, 30(3): 589-606.

[12]TRAN M H, MINKYUN N, PHUONG T T, et al. Antioxidant activity of caffeoyl quinic acid derivatives from the roots of Dipsacus asper Wall [J]. Journal of Ethnopharmacology, 2006, 108: 188-192.

[13]李瓊, 劉樂全, 徐懷德, 等. 光皮木瓜中有機酸成分研究[J]. 西北農業學報, 2008, 17(1): 207-210.

[14]張冬松, 高慧媛, 吳立軍. 光皮木瓜的化學成分藥理活性及臨床研究進展[J]. 沈陽藥科大學學報, 2007, 24(11): 721-726．

[15]RUUD H D, ELLEN E S. The evolution of Staphylococcus aureus[J]. Infection, Genetics and Evolution, 2008, 8: 747-763.

[16]RAYMOND B, MARIE D, CARLOS R, et al. Molecular epidemiology of multidrug-resistant Shigella dysenteriae type 1 causing dysentery outbreaks in Central African Republic, 2003-2004[J]. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, 2006, 100: 1151-1158.

Extraction of Chlorogenic Acid from Fruit of Chaenomeles sinensis Koehne and Evaluation of Its Antibacterial Activity

HU Zhong-qiu，HONG Xiao-di，YUE Tian-li
(College of Food Science and Engineering, Northwest A&F University, Yangling 712100, China)

Chlorogenic acid was extracted from the fruit of Chaenomeles sinensis Koehne using methanol as solvent. Effects of four extraction variables (methanol concentration, extraction temperature, solid/liquid ratio and extraction time) on yield of chlorogenic acid were investigated by conducting single factor test. Subsequently, a L9(34) orthogonal test was employed to optimize the extraction conditions. In the following, the anti-Shigella dysenteriae and Staphylococcus aureus activities were evaluated by using inhibition zone test. Results showed the optimum extractions conditions were as follows: aqueous methanol concentration 85%, the solid/liquid ratio 1:30 (C. sinensis Koehne powder(g)/aqueous methanol (mL)), extraction at 40 ℃ for 14 hours. Under the optimum conditions, the yield of chlorogenic acid were 0.142%. The antibacterial activity of chlorogenic acid samples against S. dysenteriae and S. aureus was significant. It indicated that chlorogenic acid may be a main pharmacological compound of a folk medicine of white spirit soaked with C. sinensis Koehne.

Chaenomeles sinensis Koehne；chlorogenic acid；extraction and optimization；antibacterial activity；Shigella dysenteriae；Staphylococcus aureus.

S646

A

1002-6630(2010)24-0008-06

2010-02-06

“十一五”國家科技支撐計劃項目(2006BAK02A24)

*通信作者：胡仲秋(1969—)，男，講師，博士，研究方向為天然產物提取。E-mail：hutiger-2005@126.com