響應面法優化微波提取野菊花抗氧化物質

褚福紅，陸 寧，于 新*，蔣 雨

(1.安徽農業大學茶與食品科技學院，安徽 合肥 230036；2.仲愷農業工程學院輕工食品學院，廣東 廣州 510225；3.四川農業大學食品學院，四川 雅安 625014)

響應面法優化微波提取野菊花抗氧化物質

褚福紅1,2，陸 寧1，于 新2,*，蔣 雨3

(1.安徽農業大學茶與食品科技學院，安徽 合肥 230036；2.仲愷農業工程學院輕工食品學院，廣東 廣州 510225；3.四川農業大學食品學院，四川 雅安 625014)

以野菊花花蕾為材料，研究其提取物的抗氧化活性。在乙醇體積分數、提取時間、料液比等單因素試驗的基礎上，根據中心組合試驗設計原理，應用響應面分析法研究各因素的顯著性和交互作用的強弱，對野菊花微波提取工藝進行優化。結果表明，微波提取野菊花清除DPPH自由基物質的優化工藝條件為乙醇體積分數50%、料液比1:27(g/mL)、提取時間51s。提取物質量濃度為0.6mg/mL時，DPPH自由基實際清除率達到83.23%，與理論預測值83.10 %的絕對誤差為0.13%。

響應面分析法；野菊花；微波提取；DPPH自由基

野菊花為菊科植物野菊(Chrysanthemum indicum L.)的頭狀花序，中藥材常用其花蕾，具有清熱解毒、涼肝明目之功效[1]。野菊花中主要含有黃酮類化合物[2]、綠原酸[3]、多糖[4]以及多種揮發油成分和脂肪族化合物[5]。近年來的研究表明其具有抗病毒、抗感染、降壓、抗腫瘤、提高機體免疫及抗氧化等眾多藥理作用。資料顯示，自由基損傷機體是加速人體老化的重要誘因[6]。我國野菊花分布廣泛，野菊花多糖具有清除活性氧自由基的作用[4]；其水提液對離體大鼠心、腦、肝、腎的脂質過氧化物(LPO)以及H2O2引發的紅細胞LPO和紅細胞溶血有不同程度的抑制作用，還可提高體內抗氧化酶的活力[7]；野菊花揮發油具有清除DPPH自由基活性的作用[8]。目前，響應面分析法在優化微波輔助提取野菊花抗氧化物質中的應用未見報道。

微波作為一種新型的技術近年來廣泛應用于植物化學領域[9]，它具有加熱速度快、控制方便、受熱體系溫度均勻、節能等優點[10-11]。DPPH自由基是一種人工合成的穩定的自由基，在可見光區有特征吸收，比色測定簡便快速，并具有良好的重現性，可有效評價物質的抗氧化性[12]。本實驗利用微波技術研究野菊花提取物對DPPH自由基的清除率，在單因素試驗的基礎上，通過響應面分析法[13-14]以最經濟的方式對所選實驗參數進行全面的分析和研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野菊花[巖香菊(C.lavandulaefolium(Fisch.)Mak.)的頭狀花絮] 廣州市大參林藥房；1,1-二苯基-2-苦苯肼自由基(DPPH自由基) 美國Sigma公司；無水乙醇(分析純) 廣州化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

FA1004電子分析天平 上海恒平科學儀器有限公司；MJ-176NR型多功能粉碎機 日本松下電器產業株式會社；HH數顯恒溫水浴鍋 金壇市金城國勝實驗儀器廠；G8023CSL-K3型微波爐 格蘭仕微波爐有限公司；UV-1700紫外分光光度計 日本島津分析儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 提取物對DPPH自由基清除率的測定

參照Vattem等[15]報道，配制不同濃度的提取物溶液，精確吸取2.0mL放入試管中，加入2.0×10-4mol/L DPPH自由基溶液2.0mL，搖勻后30℃放置30min，測定其在517nm波長處的吸光度(AS)；以蒸餾水代替樣品為空白對照(A0)；以2.0mL不同濃度的提取物溶液與2.0mL水混合液為樣品對照(AX)，以消除樣品本身顏色的影響。

1.3.2 工藝優化設計

1.3.2.1 單因素試驗

分別考察溶劑、料液比、提取時間等因素對野菊花微波提取物清除DPPH自由基的影響，設3次重復。

1.3.2.2 中心組合試驗設計

表1 試驗因素水平及編碼Table 1 Factors and levels of response surface experiments

結合單因素試驗結果，選取乙醇體積分數、提取時間和料液比為野菊花微波提取物清除DPPH自由基影響的3個因素，采用三因素三水平的(central composite design，CCD)試驗設計(表1)及分析方法進行提取條件的優化。

2 結果與分析

2.1 溶劑的選擇

將野菊花粉碎過100目篩，分別用水、無水乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿等不同極性的溶劑在70℃下回流提取4h，結果如圖1所示。水提物的DPPH自由基清除率最高，而氯仿提取物的DPPH自由基清除率最低，總的趨勢隨著提取溶劑極性的增強，野菊花提取物的抗氧化活性不斷提高。因此，選擇水和不同體積分數的乙醇為提取溶劑。

圖1 不同溶劑對DPPH自由基清除率的影響Fig.1 Effects of different solvents on the scavenging rate of extractfrom Chrysanthemum indicum L. to DPPH free radicals

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 乙醇體積分數對提取物清除DPPH自由基的影響在料液比1:20(g/mL)、提取時間30s、微波功率

320W的條件下，設定提取溶劑分別為水、30%乙醇、

50%乙醇、70%乙醇(均為體積分數)，試驗結果見圖2。

圖2 乙醇體積分數對DPPH自由基清除率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on the scavenging rate of extract from Chrysanthemum indicum L. to DPPH free radicals

在微波條件下，不同體積分數乙醇提取物對DPPH自由基的清除率大于水提物，50%乙醇提取物對DPPH自由基的清除率最高，其次是70%和30%的乙醇提取物。這首先是因為微波輔助會對強極性的溶劑提取顯示出優勢，其次有一定量的有機試劑存在會提高提取效率。

2.2.2 提取時間對提取物清除DPPH自由基的影響

在料液比1:20(g/mL)、提取溶劑體積分數50%乙醇、微波功率320W的條件下，設定提取時間分別為10、20、30、40、50、60、70s。結果如圖3所示，在50s之前隨著時間的延長，DPPH自由基清除率不斷提高，50s之后就出現下降趨勢。這表明，微波萃取的活性物質浸出過程與時間密切相關，時間過短，產物溶解不充分，但時間過長，活性物質有所破壞或被分解。

圖3 提取時間對DPPH自由基清除率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the scavenging rate of extract from Chrysanthemum indicum L. to DPPH free radicals

2.2.3 料液比對提取物清除DPPH自由基的影響

在乙醇體積分數50%、微波功率320W、提取時間50s的條件下。設定料液比分別為1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35(g/mL)，結果見圖4。

圖4 料液比對DPPH自由基清除率的影響Fig.4 Effect of material-liquid ratio on the scavenging rate of extract from Chrysanthemum indicum L. to DPPH free radicals

由圖4可知，隨著溶劑量提高，DPPH自由基的清除率先提高后降低，在料液比為1:25(g/mL)時清除率達到最高。前期溶劑量越大，有效成分浸出越完全，DPPH自由基的清除率也就越高；但溶劑量過多，一方面造成溶劑的浪費和能耗的增加，另一方面對微波效率也會有影響，因此確定料液比1:25(g/mL)比較合理。

2.3CCD試驗設計結果與分析

2.3.1 模型的建立及其顯著性檢驗

結合單因素試驗結果，選取乙醇體積分數、微波時間、液料比這3個因素，采用三因素三水平的CCD試驗設計(表2)及分析方法進行提取條件的優化。

表2 響應面試驗結果Table 2 Results of response surface experiments

利用Design expert V 7.0.0統計軟件對數據進行回歸擬合，得到野菊花提取物的抗氧化活性對以上3個因素的二次多項回歸模型為：

Y/%=-1.90＋1.78x1＋3.37x2-0.19x3-0.022x1x2＋9.81×10-3x1x3＋0.015x2x3-0.017x12-0.057x22-7.03× 10-3x32

表3 回歸方程可信度分析Table 3 Reliability analysis for the regression equation

回歸方程可信度分析見表3，其中R2=0.9823，表明98.23%的實驗數據可用該模型進行解釋；信噪比為26.506，遠大于4；CV值為0.54%，很低，顯示實驗穩定性好，操作可信。該回歸方程為優化提取野菊花中清除DPPH自由基的物質提供了一個良好的工藝條件模型。

表4 二次回歸方程模型方差分析Table 4 Variance analysis of the quadratic regression model

由表4可見，模型具有高度顯著性(P＜0.0001)，失擬項不顯著，又由各因素的P值可知除提取時間無顯著影響(P=0.1432)，乙醇體積分數(P=0.0484)具顯著影響外，其他各因素如二次項、方程交互項對野菊花提取物清除DPPH自由基的能力都有極顯著影響。響應值的變化相當復雜，各個具體試驗因素對響應值的影響不是簡單的線性關系。由表4中F值的大小可以判斷各因素對DPPH自由基清除率影響的強弱。F值越大，影響作用越強。各個因素對DPPH自由基清除率的影響程度大小的次序為料液比＞乙醇體積分數＞提取時間，其中料液比對DPPH自由基清除率的影響達到極顯著水平(P＜0.0001)。

2.3.2 響應曲面分析與優化

比較圖5可知：料液比對DPPH自由基清除率的影響最為顯著，表現為曲線較陡；乙醇體積分數、微波提取時間次之，表現為曲線較為平滑，且隨其數值的增加或減少，響應值變化較小。從圖5A可以看出，響應面曲線較陡，說明料液比和乙醇體積分數對DPPH自由基清除率的影響較為明顯，這與方差分析的結果相一致。圖5中等高線的形狀可反映出交互效應的強弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反。由圖5A等高線可以看出，料液比和乙醇體積分數之間的交互作用較顯著，表現為等高線呈橢圓形。相比較而言，乙醇體積分數和提取時間之間的交互作用較小。回歸模型預測的野菊花提取物清除DPPH自由基的最佳工藝條件為乙醇體積分數49.68%、料液比1:26.98(g/mL)、提取時間50.59s，此時野菊花提取物對DPPH自由基的理論值達到了83.10%。為檢驗響應面法所得結果的可靠性，采用上述優化提取條件進行野菊花微波提取，考慮到實際操作的便利，將提取工藝參數修正為乙醇體積分數50%、料液比1:27(g/mL)、提取時間51s，結果得出DPPH自由基清除率實際值為83.23%。與理論預測值83.10%非常接近。因此，基于響應面法分析所得的優化提取工藝參數準確可靠，具有實用價值。

圖5 各因素交互作用對野菊花提取物清除DPPH自由基影響的響應面和等高線Fig.5 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction of any two factors on the scavenging rate of extract from Chrysanthemum indicum L. to DPPH free radicals

3 結 論

響應面優化微波提取野菊花抗氧化物質工藝試驗結果表明，料液比顯著影響野菊花提取物對DPPH自由基的清除率(P＜0.0001)。綜合分析回歸模型確定最佳的工藝條件為乙醇體積分數50%、料液比1:27(g/mL)、提取時間51s，結果得出DPPH自由基清除率實際值為83.23%，與理論預測值的擬合度較好。

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Optimization of Microwave Extraction Conditions for Antioxidant Materials from Chrysanthemum indicum L. by Response Surface Methodology

CHU Fu-hong1,2，LU Ning1，YU Xin2,*，JIANG Yu3
(1. College of Tea & Food Science and Technology, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China；2. College of Light Industry and Food Science, Zhongkai University of Agriculture and Engineering, Guangzhou 510225, China；3. Food Science College, Sichuan Agricultural University, Ya， an 625014, China)

Chrysanthemum indicum L. was used as the raw material to extract antioxidant materials by microwave technology. On the basis of single-factor experimental results and central composite design principle, the optimal extraction processing parameters were explored by response surface experiments through evaluating the effects of ethanol concentration, extraction time, material-liquid ratio and their cross-interactions on antioxidant activity of the extract. Results indicated that the optimal extraction processing parameters were ethanol concentration of 50% (V/V), microwave treatment time of 51 s and material-liquid ratio of 1:27 (g/mL). Under these optimal extraction conditions, the scavenging rate of the extract from Chrysanthemum indicum L. at the concentration of 0.6 mg/mL on DPPH free radicals was up to 83.10%, which was close to the predicted value of 83.23% with an absolute error of 0.13%.

response surface method (RSM)；Chrysanthemum indicum L.；microwave extraction；DPPH free radicals

TS201；Q946

A

1002-6630(2010)24-0090-05

2010-02-02

廣東省科技計劃項目(2005B20401002)

褚福紅(1985—)，女，碩士研究生，研究方向為農產品加工與貯藏。E-mail：fish_fish777@126.com

*通信作者：于新(1959—)，男，教授，碩士，研究方向為農產品加工與貯藏。E-mail：yuxin1959@yahoo.com.cn