復合抑制劑對菊芋酶促褐變的影響

王衛東，孫月娥，李 超，王春燕，周繼波

(1.徐州工程學院食品工程學院，江蘇 徐州 221008；2.徐州金地杰農業發展有限公司，江蘇 徐州 221116)

復合抑制劑對菊芋酶促褐變的影響

王衛東1，孫月娥1，李 超1，王春燕1，周繼波2

(1.徐州工程學院食品工程學院，江蘇 徐州 221008；2.徐州金地杰農業發展有限公司，江蘇 徐州 221116)

采用磷酸鹽緩沖液提取菊芋中的多酚氧化酶(PPO)，并對其酶學特性進行研究。結果表明，菊芋多酚氧化酶最適溫度50℃、最適pH值為4.0和8.0。動力學實驗表明菊芋PPO的米氏常數Km39.27mmol/L、最大反應速率Vmax 為1.369U/min。通過響應面試驗設計對菊芋酶促褐變的抑制劑配方進行優化，結果表明：用質量濃度0.02g/ 100mL乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、0.02g/100mL檸檬酸亞錫二鈉和0.04g/100mL的抗壞血酸復合溶液浸泡30min，能有效防止菊芋在加工期間的酶促褐變。

菊芋；多酚氧化酶；酶促褐變；檸檬酸亞錫二鈉

多酚氧化酶(PPO，E.C.1.14.18.1)是一種含有銅離子的酶，廣泛存在于植物、動物和一些微生物中，是引起大多數果蔬發生酶促褐變的酶。在果蔬加工過程中，多酚類物質在PPO和氧氣的作用下，鄰位的酚氧化為醌，醌很快聚合成為褐色素而引起組織褐變。酶促褐變不僅有損于果蔬的感官品質，還會導致其營養價值下降。因此，果蔬褐變自20世紀50年代起就成為人們研究的對象，目前的許多問題依然還是圍繞酶及褐變機理本身[1]。許多學者對草莓[2]、梨[3]、桑葚[4]、枇杷[5]等水果中的PPO進行分離純化，并對其酶學特性進行了研究。

菊芋(Helianthus tuberosus L.)別名洋姜、鬼子姜、地姜，為菊科向日葵屬一年生草本植物。它的原產地為北美密西西比盆地，我國各地皆零星種植，其地下塊莖細密、清脆，既可炒食，又可腌漬食用，還可曬干磨成粉代替一般植物淀粉，也可以通過分離提取菊糖、低聚果糖等成品。近年來因其營養豐富，風味獨特而倍受人們青睞。菊芋在加工中很容易發生酶促褐變，有關其PPO的特性國內已有較多報道，但是并未得到比較一致的結論，而且已有的研究很少涉及到實際菊芋體系中酶促褐變的抑制。因此研究菊芋PPO的特性及其引起褐變的防止方法，可以為菊芋的開發利用提供一定的理論支持和技術指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菊芋 徐州金地杰農業發展有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

TU-1810型紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；TGL-20M高速臺式冷凍離心機 長沙湘儀離心機有限公司；PHS-3CA型精密酸度計 上海世義精密儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 PPO粗酶液的提取

稱取新鮮菊芋50g與100mL 0～4℃預冷過的0.2mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH7.0)混合，加入5g不溶性聚乙烯比咯烷酮(PVPP)后迅速勻漿30s。勻漿液用紗布過濾后在4℃、18000×g離心20min，上清液即為粗酶液。

1.3.2 PPO酶活的測定

在比色皿中加入2.4mL緩沖液、0.5mL 0.1mol/L鄰苯二酚溶液以及0.1mL粗酶液，在420nm波長處2min內每隔5s測吸光度隨時間的變化[6]。以每分鐘增加吸光度0.001的酶量為一個酶活力單位U。

式中：A為每秒鐘增加的吸光度；V為粗酶液的體積/mL。

1.3.3 PPO最適pH值的測定

按照1.3.2節中酶活的測定方法，反應液包括0.1mL粗酶液、2.4mL不同pH值的緩沖溶液、0.1mol/L鄰苯二酚溶液0.5mL，緩沖系統為Britton-Robinson緩沖溶液。

1.3.4 PPO最適溫度的測定

取2.4mL pH4.0的Britton-Robinson緩沖溶液、0.1mol/L的鄰苯二酚溶液0.5mL，在30～90℃范圍內，每隔10℃保溫5min，加入0.1mL粗酶液，然后迅速在420nm波長處測定各溫度下的吸光度，并計算PPO酶活。

1.3.5 PPO的熱穩定性

酶的熱穩定性在50、60、70、80℃時測定。取10mL粗酶液在相應溫度下加熱一定時間后，在冰浴中迅速冷卻，在室溫條件下測定PPO相對酶活。

1.3.6 底物濃度與PPO酶活的關系

用濃度0.05mol/L、pH7.0磷酸鹽緩沖溶液配制濃度0.01、0.03、0.05、0.07、0.09、0.11、0.13、0.15mol/L的鄰苯二酚作為底物，在室溫條件下測定PPO的酶活。根據Lineweaver-Burk作圖法[7]得米氏常數Km(其值為酶反應速度達到最大速度一半時的底物濃度，Km值愈大，酶與底物的親和力愈小；Km值愈小，酶與底物親和力愈大)和最大反應速率Vmax值。

1.3.7 菊芋片褐變度的測定

用全自動測色色差儀通過反射法測定菊芋片的色澤。儀器的標準白板L* = 93.53，a* = -0.82，b* = 0.10。用L*值表示菊芋片的褐變度，L*值越小，說明褐變程度越大。

1.3.8 酶促褐變抑制劑配方的優化

在預實驗基礎上，選擇抗壞血酸、檸檬酸亞錫二鈉和EDTA作為酶促褐變的抑制劑。將菊芋片浸泡于不同濃度的抑制劑中30min，瀝干水分，室溫中靜置48h后測定菊芋片的L*值。根據Box-Behnken試驗設計原理，在單因素試驗基礎上，選取檸檬酸亞錫二鈉、EDTA和抗壞血酸3個影響因素，采用三因素三水平的響應曲面分析方法，試驗因素與水平設計見表1。設該模型通過最小二乘法擬合的二次多項方程：

表1 Box-Behnken試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiment design

式中：Y為預測響應值；Xi和Xj為自變量代碼值；β0為常數項；βi為線性系數；βij為交互項系數；βii為二次項系數。

按照Box-Behnken試驗設計的統計學要求，對上述方程的各項回歸系數進行回歸擬合。

2 結果與分析

2.1pH值對PPO酶活的影響

在室溫條件下，采用鄰本二酚為底物測定不同pH值對菊芋PPO酶活的影響，結果如圖1所示。由圖1可見，菊芋中PPO有兩個最適pH值，分別為4.0和8.0，說明菊芋PPO有同工酶存在。眾多研究表明，很多果蔬中的PPO存在同工酶，如葡萄[8]、藍莓[9]、黑莓[10]等。胡建鋒等[7]測得新鮮菊芋PPO最適pH值為7.4，而錢斯日古楞[11]、劉樹文等[12]研究均發現菊芋PPO的最適pH值有兩個，分別為pH4.6、7.8和pH5.4、8.0，與本研究結果基本一致。由圖1還可看出，在極端酸性和堿性時酶的活力急劇降低，當pH＜4.0或pH＞8.0時，PPO相對活性顯著下降，pH2.0、12.0時，PPO幾乎失活。根據Lee等[8]的研究，在極端堿性環境下PPO的失活可能是由于酶蛋白的構像改變、或者迅速與美拉德反應、Strecker降解的產物發生反應。但是也有人認為在強堿條件下，銅會解離成氫氧化銅，從而使酶活性顯著降低[9]。而在pH值低于2.0的酸性環境中，酶中的銅離子被解離出來，與酶蛋白脫離，使酶失活。

圖1 pH值對菊芋PPO酶活的影響Fig.1 Effect of pH on Helianthus tuberosus L. PPO activity

2.2 溫度對PPO酶活的影響

圖2 溫度對菊芋PPO酶活的影響Fig.2 Effect of temperature on Helianthus tuberosus L. PPO activity

由圖2可見，PPO酶活先隨溫度升高而上升，在50℃時達到最大值，而后又隨溫度的升高而下降，其他溫度時，PPO相對活性比較小，特別是當溫度高于60℃，酶活急劇降低。這是因為隨著溫度升高，酶反應速度加快，當溫度高于60℃時，酶蛋白發生變性失活。因此在菊芋加工中可采用低溫或者高溫處理來抑制其PPO酶活，延緩褐變。有報道菊芋PPO的最適溫度分別為20[7]、35[11]、50℃[10]，造成如此大差異的原因可能是酶的提取方法、酶活性的測定方法以及菊芋品種的不同。

2.3PPO的熱穩定性

將菊芋PPO在不同溫度(50～80℃)保溫后，立即冰浴冷卻測定其殘余酶活，由圖3可見，菊芋PPO的熱穩定性較差。當溫度高于60℃時酶活隨著保溫時間的增加，殘余酶活迅速下降，70℃保溫3min后，殘余酶活只有原始的6%。楊政水等[15]研究發現菊芋PPO在85℃處理5min或者在90℃處理1min后，酶活幾乎全部喪失。因此在菊芋加工中，可采用熱燙的方法來鈍化PPO，抑制褐變。但是菊芋清脆的質構是其重要的特性，采用熱處理的方法要注意加熱對其質構的不利影響。在本研究中提取PPO時，菊芋經過去皮處理，因此PPO的熱穩定性明顯小于其他學者的報道，可能是菊芋皮中的PPO熱穩定性更高，需要進一步加以研究。

圖3 菊芋PPO的熱穩定性Fig.3 Thermal stability of Helianthus tuberosus L. PPO

2.4 菊芋PPO的動力學特性

圖4 底物濃度對菊芋PPO反應速度的影響Fig.4 Effect of substrate concentration on Helianthus tuberosus L. PPO activity

圖4 是鄰苯二酚底物濃度對菊芋PPO反應速度的影響。由圖4可見，當底物濃度[S]≤0.05mol/L時，酶反應速度隨底物濃度增加而增加，兩者呈正比關系，表現為一級反應。隨著[S]的進一步增加到0.05～0.09mol/L之間，反應速度不再呈比例增大，增加幅度逐漸下降，表現為混合級反應。當[S]≥0.09mol/L時，隨著底物濃度的增大，酶的活性中心已經被底物飽和，因此反應速度V達到最大值并趨于不變，表現為零級反應。

由此得出菊芋PPO活性最適反應底物濃度為0.09mol/L，并且底物濃度與PPO活性的關系遵循Michealis-Menten的酶促動力學。根據 Lineweaver-Burk方程，以1/[S]為橫坐標、1/V為縱坐標作圖(圖5)，求得米氏常數Km= 39.27mmol/L，最大反應速率Vmax= 1.369U/min。

圖5 菊芋PPO的Lineweaer-Burk圖Fig.5 Lineweaer-Burk plot for Helianthus tuberosus L. PPO

2.5 酶促褐變抑制劑的配方

2.5.1 單一抑制劑對菊芋褐變的影響

在預實驗的基礎上，選擇抗壞血酸、檸檬酸亞錫二鈉和EDTA作為酶促褐變的抑制劑。將菊芋切成3mm厚的薄片，按照菊芋:水=1:2(m/m)的比例，將菊芋片浸泡在不同濃度的抑制劑水溶液中，浸泡30min后取出，瀝干表面水分，室溫條件下靜置48h后測定菊芋片的L*值，由圖6可見，3種抑制劑對菊芋的酶促褐變都有抑制作用，當抗壞血酸濃度、檸檬酸亞錫二鈉和乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)的質量濃度分別為0.02、0.03、0.02g/ 100mL時，菊芋片的褐變度與對照相比都有顯著性差異(P＜0.05)。高于上述質量濃度，菊芋的褐變沒有顯著性差異。

圖6 抑制劑質量濃度對菊芋褐變的影響Fig.6 Effect of inhibitor concentration on the browning of Helianthus tuberosus L.

2.5.2 復合抑制劑對菊芋褐變的影響

采用Box-Behnken試驗設計對酶促褐變抑制劑的配方進行優化，試驗設計與結果見表2。

表2 Box-Behnken試驗設計和結果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments

對試驗結果進行方差分析，由表3可知，回歸模型高度顯著(P = 0.0216＜0.05)，失擬項不顯著(P = 0.1168＞ 0.05)以及R2=0.9279和RSN=7.979，遠大于4，可知回歸方程擬合度和可信度均很高，能夠很好地對抑制劑的抑制效果進行預測，不同組合條件下的預測L*值如表2所示。

由回歸模型系數顯著性檢驗結果可知，檸檬酸亞錫二鈉、EDTA和抗壞血酸對褐變的抑制有顯著影響(P值皆小于0.05)；二次項X32(P= 0.0430＜0.05)對酶促褐變的抑制有顯著影響；交互項在P=0.05水平上均不顯著，表明各個抑制劑之間沒有相互協同的作用。

表3 響應曲面二次回歸方程模型方差分析結果Table 3 ANOVA analysis for response surface quadratic model

圖7 EDTA、檸檬酸亞錫二鈉和抗壞血酸對菊芋L*值影響的響應面圖Fig.7 Response surface plot for the effect of EDTA, distannous citrate and ascorbic acid on L*of Helianthus tuberosus L.

根據回歸方程，作響應曲面圖，考察所擬合的響應曲面的形狀，分析3種抑制劑對褐變的影響。其響應曲面如圖7所示。按照模型使用快速上升法進行優化，可得抑制劑液中檸檬酸亞錫二鈉、EDTA和抗壞血酸的最佳質量濃度分別為0.02、0.02、0.04g/100mL，此條件下理論L*值為56.79。采用最佳抑制液濃度處理菊芋片，實際測得L*值為56.92，與理論值相比，其相對誤差約為0.23%，表明響應面分析方法所得的最佳工藝參數準確可靠，具有實用價值。

3 結 論

由于PPO的作用，菊芋在加工過程中容易產生酶促褐變。實驗結果表明，菊芋PPO酶反應遵循Michaelis-Menten動力學，最適溫度50℃、最適pH4.0和pH8.0。因此要盡量避免在此溫度和pH值下進行菊芋加工。檸檬酸亞錫二鈉、EDTA和抗壞血酸對菊芋的酶促褐變有較好的抑制作用，將菊芋浸泡于由0.02g/100mL檸檬酸亞錫二鈉、0.02g/100mL EDTA和0.04g/100mL抗壞血酸構成的復合抑制劑中30min，可以在48h內防止其發生褐變，但是3種抑制劑彼此之間并沒有相互協同效應。檸檬酸亞錫二鈉可以有效地防止菊芋的酶促褐變，可以作為除抗壞血酸、EDTA等傳統抗褐變劑之外的新型添加劑。

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Effect of Compound Anti-browning Agents on Enzymatic Browning of Helianthus tuberosus L.

WANG Wei-dong1，SUN Yue-e1，LI Chao1，WANG Chun-yan1，ZHOU Ji-bo2
(1. College of Food Engineering, Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou 221008, China；2. Xuzhou Excellent Land Agriculture Development Co. Ltd., Xuzhou 221116, China)

Polyphenol oxidase (PPO) was extract from Helianthus tuberosus L. using sodium phosphate buffer and its enzymatic properties of PPO were characterized. Results indicated PPO from Helianthus tuberosus L. has an optimal reaction temperature of 50 ℃ and optimal pH of 4.0 or 8.0. The enzymatic kinetic parameters including Km and Vmax were 39.27 mmol/L and 1.369 U/ min, respectively. Response surface methodology was used to explore the best anti-browning formula, which were 0.02% EDTA (m/V), 0.02% distannous citrate (m/V) and 0.04% ascorbic acid (m/V) for 30 min during treatment process.

Helianthus tuberosus L.；polyphenol oxidase；enzymatic browning；distannous citrate

TS202.3

A

1002-6630(2010)24-0134-05

2010-02-26

徐州工程學院培育項目(XKY2009216)；蘇北科技發展計劃項目(SBN200910087)

王衛東(1971—)，男，講師，博士，研究方向為食品資源開發與利用。E-mail：wwd.123@163.com