瑣瑣葡萄果實總黃酮提取工藝

祖麗皮亞·玉努斯

(新疆大學生命科學與技術學院，新疆 烏魯木齊 830046)

瑣瑣葡萄果實總黃酮提取工藝

祖麗皮亞·玉努斯

(新疆大學生命科學與技術學院，新疆 烏魯木齊 830046)

研究瑣瑣葡萄果實總黃酮的醇法提取工藝。在考察各影響因素的基礎上設計正交試驗，得出各種因素對提取效果影響的主次順序為料液比＞提取時間＞提取溫度＞乙醇體積分數，總黃酮提取最佳工藝條件為：提取溫度80℃、乙醇體積分數60%、提取時間120min、料液比1:30(g/mL)。

瑣瑣葡萄；總黃酮；提取工藝

瑣瑣葡萄是葡萄科(Vitaceae)葡萄屬(Vitis)植物山葡萄(Vitis vinifera L.)的果實，主產于新疆吐魯番、鄯善、和田等地。果實含果糖、葡萄糖、蘋果酸、檸檬酸、維生素類、氨基酸類及黃酮類等成分[1]。主治氣血虛弱、肺虛咳嗽、心悸盜風、濕痹痛、淋病、浮腫。李時珍在《本草綱目拾遺》中詳細論述了產自吐魯番的瑣瑣葡萄的藥用價值，說它大若五味子，形如胡椒，小兒食之，能解痘毒[2]。時至今日，瑣瑣葡萄仍是維吾爾人用來治療小兒麻疹的首選良藥[3]。

本實驗對瑣瑣葡萄總黃酮提取工藝進行研究，以期獲得最佳提取工藝，可為利用瑣瑣葡萄工業化生產黃酮類藥用成分提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

瑣瑣葡萄(Vitis vinifera L.)，采自中國科學院新疆分院吐魯番沙漠植物站。

蕓香葉苷(蘆丁，rutin) 中國醫藥集團上海化學試劑公司；乙醇、石油醚、甲醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉等試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

RE-52A型旋轉蒸發儀、BT-23I型水浴鍋 上海亞榮生化儀器廠；LDZX-40BI型高壓蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械廠；THZ-82型恒溫培養箱 金壇市國旺實驗儀器廠；752型分光光度計 上海元析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的制備[4]

精密稱取在120℃恒溫干燥至質量恒定的蘆丁標準品25mg置于100mL容量瓶中，加70%乙醇50mL置水浴上微熱使溶解，放冷，加70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得所需標準液(0.25mg/mL)。

1.3.2 樣品溶液的制備[4]

取瑣瑣葡萄，置恒溫箱中干燥24h，研碎，用石油醚脫脂后在恒溫箱里干燥2h。精密稱量10g用過濾紙包好置索氏提取儀中按一定的料液比加入乙醇溶液，在80℃下加熱回流一定時間，移去回流液，用少量70%乙醇洗滌容器，減壓蒸餾回收乙醇，過濾回流液，移至250mL容量瓶。用少量70%乙醇洗滌容器，洗液并入容量瓶中，用70%乙醇定容，搖勻即得樣品溶液。

1.3.3 最佳測定波長的選擇[5]

取蘆丁標準溶液2.0mL置于25mL容量瓶中，加入5%亞硝酸鈉溶液1mL，搖勻，放置10min。加入1%硝酸鋁溶液1mL，搖勻，放置10min。加入4%氫氧化鈉溶液10mL，加水定溶，搖勻，放置15min。以空白作對照，用752分光光度計在450～550nm間掃描，確定最佳測定波長。

1.3.4 標準曲線繪制

精確吸取標準溶液0.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、0.7mL分別置于25mL容量瓶中，分別加入5%亞硝酸鈉溶液1mL搖勻，靜置10min，加入1%硝酸鋁溶液1mL搖勻，靜置10min，加入4%氫氧化鈉溶液10mL，70%乙醇定容至刻度靜置15min。在500nm波長處測溶液的吸光度，得到蘆丁標準溶液的工作曲線，用最小二乘法進行線性回歸，得回歸方程：C=0.0894A-0.0005，相關系數r=0.9989，表明有良好的線性關系，作為瑣瑣葡萄中總黃酮含量的測定方法。

1.3.5 穩定性實驗[5]

按照1.3.4節標準曲線繪制方法，對標準品和樣品溶液放置一定時間后測定吸光度，考察其穩定性。

1.3.6 總黃酮提取工藝單因素試驗[6-9]

分別研究提取劑種類、樣品脫脂與不脫脂的區別、提取時間、提取劑體積分數、提取溫度、料液比等因素對瑣瑣葡萄果實總黃酮含量的影響。

1.3.7 提取工藝條件的優化[10-12]

為了確定最佳工藝條件，參考有關資料，確定以乙醇體積分數、提取時間、提取溫度、料液比4種因素進行正交試驗設計及測定。

2 結果與分析

2.1 總黃酮含量的測定結果

2.1.1 最大吸光度的測定

如圖1所示，顯示蘆丁在500nm處吸光度最大，即最佳測定波長為500nm。

圖1 蘆丁最大吸光度的測定Fig.1 Determination of maximum absorbance wavelength for rutin

表1 穩定性實驗結果Table 1 Results of stability experiments

2.1.2 穩定性實驗結果

取標準溶液和樣品溶液各2.0mL，按1.3.4和1.3.5節方法操作，每隔5min測一次。結果如表1所示。

表1結果顯示：標準溶液在配制后的2h內穩定性良好。樣品溶液在配制后的1h內穩定性良好。

計算相對標準偏差(RSD)為：標準溶液的RSD0.62%，樣品溶液的RSD 2.5%。

2.2 單因素試驗

2.2.1 黃酮提取劑的確定

在提取溫度80℃、提取時間1h、瑣瑣葡萄2g、溶劑用量20mL條件下，分別用甲醇、乙醇和水進行提取，以分光光度計測定提取液的吸光度，選擇最好的提取溶劑。結果見圖2。

圖2 不同提取溶劑的浸提效果比較Fig.2 Effect of solvent type on extraction rate of total flavonoids

由圖2可知：采用水提取效果最差，原因是一些大分子物質(蛋白質，糖類等)溶出而引入雜質，使得過濾很難。甲醇提取效果好于水，但甲醇有毒性，而乙醇的提取不易引入雜質，產品純度高，所以選擇乙醇作為最佳的提取溶劑。

2.2.2 樣品脫脂與不脫脂的區別

在提取溫度80℃、提取2次、每次1h、瑣瑣葡萄量2g、乙醇溶液用量20mL條件下。考察提取前對原料進行脫脂和不脫脂對提取效果的影響。

圖3 樣品脫脂與不脫脂的區別Fig.3 Effect of degreasing treatment on extraction rate of total flavonoids

圖3 結果顯示，在相同乙醇體積分數條件下，用石油醚脫脂后的提取效果好于不脫脂的提取效果，這是因為在提取過程中，提取溶劑對脂類物質的溶解，降低了對黃酮類物質的溶解，所以提取前先用石油醚對原料進行脫脂，可以提高總黃酮的得率。

2.2.3 提取時間的影響

圖4 提取時間對浸提效果的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction rate of total flavonoids

稱取5g瑣瑣葡萄，用50mL 70%乙醇溶液在室溫下浸泡。檢查提取時間對黃酮提取效果的影響。圖4結果顯示，0～120min期間溶液的吸光度增大，120min后吸光度降低，原因是高溫條件黃酮類物質會損壞，因此最好的提取時間定為120min。

2.2.4 乙醇體積分數的影響

黃酮類物質在不同體積分數的乙醇溶液中溶解度有所不同，所以提取過程中所用的乙醇溶液的體積分數對提取效果有一定的影響，用不同體積分數的乙醇溶液進行提取，比較其結果，選擇最佳乙醇體積分數。由圖5可知，用60%乙醇溶液提取效果最好。

圖5 乙醇體積分數對提取效果的影響Fig.5 Effect of ethanol concentration on extraction rate of total flavonoids

2.2.5 提取溫度的影響

在不同溫度條件下進行最佳提取溫度的選擇，圖6結果表明，80℃是最佳的提取溫度。

圖6 提取溫度對提取效果的影響Fig.6 Effect of extraction temperature on extraction rate of total flavonoids

2.2.6 料液比的影響

取4個料液比水平進行試驗，表2結果表明，最佳提取料液比為1:30(g/mL)。

表2 料液比對浸提效果的影響Table 2 Effect of material-liquid ration on extraction rate of total flavonoids

2.3 提取工藝條件的優化

表3 正交試驗因素水平Table 3 Factors and levels of orthogonal experiments

由表3、4可知，各種因素對提取效果影響的主次順序為料液比＞提取時間＞提取溫度＞乙醇體積分數。瑣瑣葡萄中黃酮的最佳提取工藝為A2B3C4D3，即提取溫度80℃、料液比1:30(g/mL)、乙醇體積分數60%、提取時間120min。

表4 L9(34)的正交試驗結果及分析Table 4 Results and analysis of orthogonal experiments

3 結 論

結果表明瑣瑣葡萄果實中黃酮類物質的最大吸光度波長為500nm。從瑣瑣葡萄中提取黃酮類化合物的最佳工藝：提取溫度80℃、乙醇體積分數60%、提取時間120min、料液比1:30(g/mL)。

[1]新疆維吾爾自治區衛生廳. 維吾爾藥材標準: 上冊[M]. 烏魯木齊: 新疆科技衛生出版社, 1993: 347.

[2]劉勇民, 沙吾提·伊克木. 維吾爾藥志: 上冊[M]. 烏魯木齊: 新疆人民出版社, 1986: 365.

[3]如克婭·沙德克. 維吾爾醫常用藥材學: 下冊[M]. 烏魯木齊: 新疆科技衛生出版社, 1993: 323.

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[8]白玉霞, 把根那, 伊拉圖. 正交設計研究文冠木總黃酮的提取工藝[J]. 中成藥, 1998, 20(9): l-3.

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Extraction Processing of Total Flavonoids from Vitis vinifera L.

ZULFIYA Yunus. ...
(College of Life Sciences and Technology, Xinjiang University, Urumqi 830046, China)

The influence order of the factors on extraction efficiency was material-liquid ratio, extraction time, extraction temperature and ethanol concentration. The optimal extraction processing parameters of total flavonoids from Vitis vinifera L. were explored by single-factor and orthogonal experiments to be extraction temperature of 80℃, ethanol concentration of 60%, extraction time of 120 min and material-liquid ratio of 1:30 (g/mL).

Vitis vinifera L.；total flavonoids；extraction processing

O623.54

A

1002-6630(2010)24-0159-04

2010-01-25

祖麗皮亞·玉努斯(1970—)，女，副教授，碩士，研究方向為資源生物及微生物。E-mail：zulfiya_yunus@126.com