桑黃總黃酮超聲提取工藝及其生物活性研究

回 晶，李其久，邊媛媛，尤 田，龐 沖，吳 娜，胡風慶

(1.遼寧大學生命科學院，遼寧 沈陽 110036；2.遼寧省中醫藥研究院，遼寧 沈陽 110034)

桑黃總黃酮超聲提取工藝及其生物活性研究

回 晶1，李其久1，邊媛媛1，尤 田2，龐 沖1，吳 娜1，胡風慶1

(1.遼寧大學生命科學院，遼寧 沈陽 110036；2.遼寧省中醫藥研究院，遼寧 沈陽 110034)

目的：優化提取桑黃總黃酮的最佳工藝條件，測定其體外抗氧化活性和對癌細胞的生長抑制作用。方法：以樣品中總黃酮的提取率為指標，采用L9(34)正交試驗對桑黃的超聲輔助提取工藝參數進行優化；通過測定桑黃黃酮對·OH、O2·的清除能力等指標，探討其抗氧化活性；采用MTT法測定桑黃黃酮對大腸癌細胞CX-1增殖反應的影響，研究其體外抗腫瘤活性。結果：桑黃總黃酮的最佳提取工藝為乙醇體積分數55%、料液比1:20(g/ mL)、提取溫度70℃、超聲提取時間1.5h。桑黃黃酮可以有效清除·OH、O2·，對Fe2+誘發卵黃低密度脂蛋白(LDL)多不飽和脂肪酸(PUFA)過氧化反應具有抑制作用。桑黃黃酮提取物能夠有效地抑制大腸癌細胞CX-1的生長。結論：該工藝提取桑黃總黃酮，方法簡單、耗時短。桑黃黃酮抗氧化能力強，有抑制癌細胞的作用，是一種有效的天然抗氧化劑。

桑黃；總黃酮；正交試驗；抗氧化；生長抑制

桑黃(Phellinus igniarius)是擔子菌亞門(Basidiomycota)、層菌綱(Hymenomycetes)、非褶菌目(Aphyllophorales)、銹革孔菌科(Hymenochaetaceae)、針層孔菌屬(Phellinus)的藥用真菌[1]。現代研究表明桑黃具有抗腫瘤，增強免疫力、抗發炎、抗氧化、預防和治療關節炎、保護肝臟、抗糖尿病、抗胃潰瘍等多種藥理活性[2-5]。其特有的抗腫瘤活性及低毒性使其成為研究熱點[6-7]，因此該菌是一種極具研究和開發價值的食藥用真菌。本研究對桑黃黃酮的提取工藝及生物活性進行研究，以期為進一步開發利用桑黃提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑黃子實體購于東北食藥用真菌研究所，由本院微生物系郭叔凡副教授鑒定，粉碎過篩備用。蘆丁標準品(純度99%，批號TCM027-080118) 南京替斯艾么中藥研究所；大腸癌細胞系CX-1 中國醫科大學；DMEM高糖培養基 HyClone公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT) BBI公司；其余化學試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

BS223S型電子天平 德國賽多利斯公司；KQ2200DB型數控超聲波清洗器；RE52CS-2旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；BB15 CO2培養箱 Heraeus公司；Multiskan MK3酶標儀 Thermo Labsystems公司；分光光度計。

1.3 方法

1.3.1 標準曲線繪制[8]

精密稱取蘆丁標準品20mg，置50mL容量瓶中，加70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得0.4mg/mL蘆丁標準液備用。準確吸取標準蘆丁溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7mL，置于試管中。加70%乙醇至5mL，再加入5mL顯色液(硼酸0.4g、乙酸鈉0.5g、用70%乙醇稀釋至50mL)，混勻，加相應試劑做空白，處理后置比色杯中，在波長385nm處測定其吸光度，以蘆丁質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程y=19.796x＋0.0153，R2=0.9967。

1.3.2 超聲提取總黃酮工藝優化

根據黃酮提取工藝的文獻報道[9-11]，選擇影響桑黃總黃酮提取的4個因素，即料液比、提取溫度、提取時間和乙醇體積分數，每個因素取3個水平，超聲頻率固定為90Hz，以提取率作為評價指標對超聲提取工藝進行正交試驗優化(表1)。

表1 超聲提取總黃酮正交試驗因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for optimizing the extraction processing of total flavonoids from Phellinus igniarius

1.3.3 總黃酮的鑒別

鹽酸-鎂粉反應：取桑黃總黃酮提取液1mL于試管中，加入少量鎂粉振搖，再滴入幾滴濃鹽酸，1min后溶液均顯紫紅色。

三氯化鋁顯色反應：取桑黃總黃酮提取液適量和1%三氯化鋁乙醇溶液通過紙斑反應后，置于紫外燈下，均顯鮮黃色熒光。

1.3.4 桑黃總黃酮含量的測定及提取率

取正交試驗各桑黃提取液，抽濾，定容到100mL。精密吸取上述溶液0.2mL，按照1.3.1節方法測其吸光度，按照回歸方程計算提取液中的總黃酮含量。

1.3.5 桑黃總黃酮的體外抗氧化活性研究

按正交試驗最優提取工藝提取桑黃總黃酮，進行體外抗氧化實驗和腫瘤細胞增殖抑制實驗。

1.3.5.1 對羥自由基清除率的測定[12]

利用H2O2對Fe2+混合產生·OH，在體系內加入水楊酸捕捉·OH并產生有色物質，該物質在波長510nm處有最大吸收。反應體系中含有2mL 9mmol/L FeSO4、2mL 9mmol/L水楊酸-乙醇、不同濃度的桑黃黃酮溶液2mL，最后加2mL 8.8mmol/L H2O2啟動反應，37℃反應0.5h，以蒸餾水為參比，在波長510nm處測量各濃度的吸光度。考慮到本身的吸光度，以2mL 9mmol/L FeSO4、2mL 9mmol/L水楊酸-乙醇、不同濃度的桑黃黃酮溶液2mL為黃酮的本底吸收。

式中：A0為對照(以蒸餾水代替黃酮樣品)的吸光度；Ai為加不同濃度黃酮樣品時的吸光度；A0i為無H2O2時黃酮樣品的吸光度。

1.3.5.2 對超氧陰離子自由基清除率的測定[12]

采用鄰苯三酚自氧化法，取4.5mL pH8.2 50mmol/L Tris-HCl緩沖溶液，混勻后在25℃水浴中保溫20min，先加入不同濃度的黃酮溶液，用蒸餾水補足到8.7mL，取出后立即加入在25℃預熱過的0.3mL 3mmol/L鄰苯三酚(以10mmol/L HCl配制，空白管用10mmol/L HCl代替鄰苯三酚的HCl溶液)，迅速搖勻后倒入比色杯，325nm波長處每隔30s測定吸光度，計算線形范圍內每分鐘吸光度的增加。然后按下述方法計算清除率。

式中：ΔA0為鄰苯三酚的自氧化法速率差；ΔA為加入黃酮溶液后鄰苯三酚自氧化法速率差。

1.3.5.3 對Fe2+誘發卵黃低密度脂蛋白(LDL)多不飽和脂肪酸(PUFA)過氧化反應的抑制作用[13]

取7支具塞刻度試管，分別加入0.2mL 1:25稀釋的卵黃懸濁液(卵黃用等體積pH7.4的磷酸緩沖液配成，用前進行磁力攪拌10min)，再分別加入1mL不同濃度的桑黃黃酮樣液、0.2mL 25mmol/L FeSO4·7H2O溶液，用磷酸緩沖液補足2mL，置37℃恒溫水浴中振蕩30min，取出后加入0.5mL質量分數20%三氯乙酸溶液和1mL質量分數0.85%硫代巴比妥酸(TBA)，混勻，置100℃水浴保溫20min，冷卻后于3500r/min離心15min，取3mL上清液測定532nm處的吸光度。用VC標準液作對照。

式中：A0為對照品(以蒸餾水代替黃酮樣品)的吸光度；A為加不同濃度黃酮樣品時的吸光度。

1.3.6 桑黃總黃酮對大腸癌細胞生長的抑制作用

將CX-1腫瘤細胞以2×105個/mL接種于96孔板中，每孔100μL。實驗組分別加入100μL質量濃度10、5、2.5、1.25、0.625μg/mL桑黃黃酮溶液，以5μg/mL 5-氟尿嘧啶(5-Fu)作為陽性對照，以質量濃度5μg/ mLBSA作為陰性對照，空白對照組用培養基代替受試藥物，每組設6個平行孔，于5% CO2、37℃細胞培養箱中培養24h，換液，繼續培養48h后，棄上清液，每孔加入50μL 5mg/mLMTT溶液，于5% CO2、37℃細胞培養箱中繼續培養4h，終止培養后離心96孔板，去上清液，每孔加150μL DMSO溶解10min，酶聯免疫檢測儀振蕩，于波長570nm測定OD值。并計算細胞抑制率。

2 結果與分析

2.1 桑黃總黃酮提取工藝優化

表2 正交試驗設計及結果Table 2 Design and results of orthogonal experiments for optimizing the extraction processing of total flavonoids from Phellinus igniarius

由表2極差值可以看出，各因素對桑黃總黃酮的提取影響程度為D＞B＞A＞C，即乙醇提取溶劑的體積分數是影響桑黃總黃酮提取的主要因素，其次是溫度，再次是料液比，對黃酮提取含量影響最小的是提取時間。

結果表明，桑黃總黃酮提取的最佳條件組合為A3B3C3D1，即料液比1:20(g/mL)、提取溫度70℃、提取時間1.5h、乙醇體積分數55%。

2.2 驗證實驗

最優的提取工藝為A3B3C3D1，并未在正交試驗中進行，需進行驗證實驗。按1.3.4節方法測得總黃酮提取率為1.614%，結果與正交試驗結論一致。

2.3 桑黃總黃酮的體外抗氧化研究

2.3.1 桑黃總黃酮清除羥自由基能力測定

表3 桑黃總黃酮清除羥自由基能力測定(±s, n=3)Table 3 Scavenging capability of total flavonoids from Phellinusigniarius on hydroxyl free radicals (±s, n=3)

表3 桑黃總黃酮清除羥自由基能力測定(±s, n=3)Table 3 Scavenging capability of total flavonoids from Phellinusigniarius on hydroxyl free radicals (±s, n=3)

樣品質量濃度/(mg/mL) A510nm清除率/%樣品組本底組0.00(CK) 0.162±0.005-0.080.162±0.0090.056±0.00234.57 0.160.202±0.0060.112±0.00644.44 0.320.235±0.0050.155±0.00550.62 0.640.329±0.0010.260±0.00657.41 VC(0.08)0.165±0.0020.025±0.00313.58

采用水楊酸法，固定反應時間測定桑黃黃酮樣品對·OH的清除作用。結果見表3，在實驗測定的質量濃度范圍內，桑黃黃酮對羥自由基的清除能力隨黃酮質量濃度的增大而增大。在質量濃度0.64mg/mL時，對羥自由基的清除率達到57.41%以上，清除效果較好。

2.3.2 桑黃總黃酮清除超氧陰離子自由基能力的測定

表4 桑黃總黃酮清除超氧陰離子自由基能力的測定 (±s, n=3)Table 4 Scavenging capability of total flavonoids from Phellinus igniarius on superoxide anion free radicals (±s,n=3)

表4 桑黃總黃酮清除超氧陰離子自由基能力的測定 (±s, n=3)Table 4 Scavenging capability of total flavonoids from Phellinus igniarius on superoxide anion free radicals (±s,n=3)

注：*.P＜0.05，與對照組相比差異顯著。

?

從表4可以看出，在實驗測定的質量濃度范圍內，桑黃黃酮對超氧陰離子自由基的清除能力隨質量濃度的增加呈增大的趨勢，在質量濃度0.64mg/mL時，對超氧陰離子自由基的清除能力已達到67.3%以上。除0.08mg/ mL樣品組與對照組相比無差異外，其他組與對照組相比差異顯著。桑黃黃酮提取物具有很好的清除超氧陰離子自由基能力。

2.3.3 對Fe2+誘發卵黃低密度脂蛋白多不飽和脂肪酸(PUFA)過氧化反應的抑制作用

由表5可以看出，桑黃黃酮提取物和VC對Fe2+誘發卵黃低密度脂蛋白多不飽和脂肪酸(PUFA)過氧化具有明顯的抑制作用，抑制作用隨樣品質量濃度的升高而增強。其中桑黃黃酮提取物0.04、0.08mg/mL組與空白組相比差異顯著，0.016、0.32、0.64mg/mL組與空白組相比差異極顯著。但同濃度條件下桑黃黃酮提取物實驗組與VC相比無顯著性差異。

表5 桑黃總黃酮提取物對PUFA過氧化反應的抑制結果(±s, n=3)Table 5 Inhibitory effect of total flavonoids from Phellinus igniarius on peroxidation reaction of PUFA in yolk induced by Fe2+±s, n=3)

表5 桑黃總黃酮提取物對PUFA過氧化反應的抑制結果(±s, n=3)Table 5 Inhibitory effect of total flavonoids from Phellinus igniarius on peroxidation reaction of PUFA in yolk induced by Fe2+±s, n=3)

注：*.P＜0.05，與對照組相比差異顯著；**.P＜0.01，與對照組相比差異極顯著。

?

2.4 桑黃總黃酮對大腸癌細胞CX-1的增殖抑制作用

表6 桑黃總黃酮對大腸癌CX-1的增殖抑制作用(±s, n=4)Table 6 Inhibitory effect of total flavonoids from Phellinus igniarius on the growth of human colorectal cancer CX-1 cells (±s, n=4)

表6 桑黃總黃酮對大腸癌CX-1的增殖抑制作用(±s, n=4)Table 6 Inhibitory effect of total flavonoids from Phellinus igniarius on the growth of human colorectal cancer CX-1 cells (±s, n=4)

注：*.P＜0.05，與對照組相比差異顯著。

?

由表6可知，空白對照組細胞體外生長良好，5種質量濃度的桑黃黃酮溶液對大腸癌細胞都表現出抑制作用，隨著桑黃黃酮提取物質量濃度的升高，其抑制細胞生長的能力越強，劑量效應關系明顯。通過方差分析可知，樣品1、樣品2與空白對照組相比，差異顯著；DMSO、BSA與空白對照組相比，無差異；樣品3與樣品4相比較，無差異。

3 結 論

超聲波輔助提取桑黃黃酮方法簡單，時間短，最佳提取工藝條件：料液比1:20(g/mL)，提取溫度70℃、提取時間1.5h、乙醇體積分數55%。

桑黃黃酮對堿性鄰苯三酚自氧化產生的超氧陰離子自由基、Fenton反應產生的羥自由基和Fe2+誘發卵黃低密度脂蛋白(LDL)多不飽和脂肪酸(PUFA)過氧化產生的烷氧基(LO·)和烷過氧基(LOO·)均有明顯的抑制作用，且均呈現一定的量效關系。其清除自由基的原理是該化合物具有酚羥基，能與自由基反應，形成共振穩定的半醌式自由基而中斷鏈式反應。共振半醌式自由基的穩定性越大，黃酮類化合物的抗氧化活性越強。桑黃總黃酮抗脂質過氧化的機理可能與Gulcin等[14]的報道相一致。其抗脂質過氧化機理主要分為兩部分，其一是通過供氫與氧化過程中產生的氧自由基(ROS)結合，終止脂質過氧化的鏈式反應，達到抑制氧化的作用。其二是與Fe2+螯合。金屬離子Fe2+、Cu2+等是脂質過氧化的重要促進劑，其主要作用是促進過氧化脂(ROOH)和脂分子(RH)的分解和氧分子活化產生自由基，從而可以進入脂質氧化鏈式反應，促進反應發生。

桑黃黃酮提取物對人大腸癌細胞CX-1有明顯的生長抑制作用，且呈一定量效關系。

通過生物體外實驗表明，桑黃總黃酮具有體外抗氧化活性及癌細胞生長抑制作用，為其在生物體內實驗奠定了實驗基礎，為其作為抗氧化藥物、保健品提供了參考。下一步的研究工作將對提取物中的黃酮作進一步的分離、純化和鑒定，探討各黃酮組分在抗氧化活性和對癌細胞生長抑制中所起的作用及其機制，為進一步揭示桑黃黃酮提取物抗氧化活性和抗癌機理提供理論依據。

[1]張小青, 戴玉成. 中國真菌志[M]. 北京: 科學出版社, 2005: 117-191.

[2]SASAKI T, FUJII K, SUGURA M, et al. Antitumor polysaccharides from some polyporaceae, Ganderma. Applanatum (Pers.) Pat and Phellinus linteus (Berk.&Curt) Teng[J]. Chem Pharm Bull, 1971, 19: 821.

[3]AJITH T A, JANARDHANAN K K. Cytotoxic and antitumor activities of a polypore macrofungus, Phellinus rimosus (Berk) Pilat[J]. Ethnopharmacol, 2003, 84(2): 157-162.

[4]張萬國, 胡晉紅, 蔡溱, 等. 桑黃抗大鼠肝纖維化作用實驗研究[J].中醫藥學刊, 2001, 19(5): 518-519.

[5]SHON M Y, KIM T H, SUNG N J. Antioxidants and free radical scavenging activity of Phellinus baumii (Phellinus of Hymenochaetaceae) extracts[J]. Food Chemistry, 2003, 82: 593-597.

[6]RAYNUD C M, SABATIER L, PHILIPOT O, et al. Telomere length, telomeric proteins and genomic instability during the multistep carcinogenic process[J]. Crit Rev Oncol Hematol, 2008, 66(2): 99-117.

[7]CAIRNEY C J, KEITH W N. Telomerase redefined: integrated regulation of hTR and hTERT for telomere maintenance and telomerase activity [J]. Biochimie, 2008, 90(1): 13-23.

[8]劉艷芳, 楊焱, 賈薇, 等. 藥用真菌桑黃總黃酮測定方法研究[J]. 食用菌學報, 2006, 13(2): 45-48.

[9]舒馨, 劉雄民, 王巧. 八角和八角殘渣總黃酮提取工藝優化[J]. 食品科學, 2010, 31(6): 65-69.

[10]劉亞敏, 劉玉民, 馬明, 等. 楓香樹葉總黃酮提取工藝優化及含量動態變化[J]. 食品科學, 2010, 31(4): 35-38.

[11]夏國華, 戈延茹, 傅海珍, 等. 超聲法提取桑黃總黃酮的工藝研究[J].江蘇大學學報: 醫學版, 2010, 20(1): 40-41.

[12]莫開菊, 柳圣, 程超. 生姜黃酮的抗氧化活性研究[J]. 食品科學, 2006, 27(9): 110-115.

[13]張海生, 陳錦屏. 蜂蛹黃酮的提取及體外抗氧化作用的研究[J]. 食品科學, 2008, 29(2): 158-162.

[14]GULCIN I, BEYDEMIR S, ALICI H A, et al. In vitro antioxidant properties of morphine[J]. Pharmacological Research, 2004, 49: 59-66.

Ultrasound-assisted Extraction and Biological Activity of Total Flavonoids from Phellinus igniarius

HUI Jing1，LI Qi-jiu1，BIAN Yuan-yuan1，YOU Tian2，PANG Chong1，WU Na1，HU Feng-qing1
(1. Faculty of Life Sciences, Liaoning University, Shenyang 110036, China；2. Liaoning Province Academic of Traditional Chinese Medicine, Shenyang 110034, China)

Objective: To optimize the extraction conditions of total flavonoids from Phellinus igniarius and determine its antioxidant activity and inhibition effect on the growth cancer cells. Methods: The ultrasound-assisted extraction processing parameters for total flavonoids from Phellinus igniarius were optimized by orthogonal experiments through evaluating the extraction rate of total flavonoids. The antioxidant activity of total flavonoids was explored by evaluating the scavenging capability on hydroxyl and superoxide anion free radicals. The anti-tumor activity of total flavonoids was evaluated by MTT assays through determining the inhibition effect on the proliferation of human colorectal cancer CX-1 cells in vitro. Results: The optimal extraction processing parameters were ethanol concentration of 55%, extraction temperature of 70 ℃, material-liquid ratio of 1:20 (g/mL) and extraction time of 1.5 h. The total flavonoids from Phellinus igniarius exhibited strong scavenging capability on hydroxyl and superoxide anion free radicals. Meanwhile, the total flavonoids could effectively inhibit the peroxidation of polyunsaturated fatty acids. Moreover, the total flavonoids had strong inhibitory effect on the growth of human colorectal cancer CX-1 cells. Conclusion: This extraction processing for total flavonoids is sample and convenient. The total flavonoids from Phellinus igniarius have strong antioxidant activity and strong inhibitory effect on the growth of cancer cells. Therefore, The total flavonoids from Phellinus igniarius have a promising potential as the effective natural antioxidant and anticancer components.

Phellinus igniarius；total flavonoids；orthogonal experiment；antioxidation；growth inhibition

O623.54

A

1002-6630(2010)24-0195-04

2010-09-26

遼寧省教育廳科學基金項目(L2010150)；沈陽發改委高技術研發基金項目(2010-16)；遼寧大學青年科研基金項目(2008LDQN25)

回晶(1977—)，女，講師，博士，研究方向為功能性食品。E-mail：huijing@lnu.edu.cn