高效液相色譜法同時檢測糧谷中的黃曲霉毒素和赭曲霉毒素

楊 琳，張宇昊,2，馬 良,2,*

(1.西南大學食品科學學院，重慶 400715； 2.重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶 400715)

高效液相色譜法同時檢測糧谷中的黃曲霉毒素和赭曲霉毒素

楊 琳1，張宇昊1,2，馬 良1,2,*

(1.西南大學食品科學學院，重慶 400715； 2.重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶 400715)

建立糧谷類食品中黃曲霉毒素(B1、B2、G1和G2)和赭曲霉毒素A的同時檢測方法。樣品經過甲醇-水(80:20，V/V)提取，液液萃取凈化和富集后，三氟乙酸衍生，采用Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6mm× 250mm)，以乙腈和體積分數2%冰醋酸溶液為流動相梯度洗脫，在線變換波長熒光檢測。根據3倍信噪比的峰響應值，確定黃曲霉毒素(B1、B2、G1和G2)和赭曲霉毒素A檢出限分別為0.06、0.03、0.18、0.05μg/kg和0.51μg/kg，上述5種毒素分別在質量濃度0.05～100、0.125～25.00、0.05～100、0.125～25.00μg/L和0.05～50.00 μg/L范圍內呈線性相關，相關系數r分別為0.9998、0.9998、0.9998、0.9996和0.9998；在玉米、大米、小麥3類樣品中加標回收率平均為71.73%～115.37%，相對標準偏差為3.00%～9.88%，方法學驗證結果表明，黃曲霉毒素和赭曲霉毒素A 5種毒素同時檢測結果與現行國標的單獨檢測方法檢測結果無顯著性差異(P＞0.05)。

高效液相色譜；真菌毒素；同時檢測；糧谷

黃曲霉毒素(AFT)和赭曲霉毒素(OT)是真菌毒素中毒性最大的兩類毒素[1]，1993年AFT被國際癌癥研究機構(IARC)列為一類致癌物，赭曲霉毒素中的赭曲霉毒素A (OTA)則被列為二類致癌物。AFT和OT不僅毒性強，而且污染范圍極廣，AFT對糧食和飼料的危害有不少報道，檢出率高達80%～100%[2-3]，OT則被許多國家檢出大量污染糧食作物[4-6]，更有資料表明AFT和OTA常常同時污染同一糧食作物[7]，而且存在毒性的加性效應[8]。目前雖然AFT和OTA的分別測定方法已比較成熟，很多學者都做了大量的研究，但其分別測定成本較高，試劑損耗嚴重且測定耗時，工作量大。而對AFT和OT進行同時檢測可有效解決上述問題，縮短分析時間，提高食品安全性。目前對食品、農產品中AFT和OT等真菌毒素的單獨檢測方法主要有薄層色譜法、酶聯免疫吸附法、熒光光度法、膠體金免疫層析法和高效液相色譜法等[9]，但對其進行同時檢測的報道較少，雖有少數文獻建立了其同時檢測方法[10-16]，但其方法成本高，設備昂貴，不能在一般實驗室大面積推廣使用，因而受到限制，本實驗采用液液萃取凈化-三氟乙酸柱前衍生-高效液相色譜法配制可變波長熒光檢測器同時檢測AFT和OTA，可為糧食中AFT和OTA的限量檢測提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

玉米、大米、小麥均購于超市，產于重慶地區。

乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純)、正己烷(分析純) 天津四友公司；冰醋酸(色譜純)、三氟乙酸(分析純) 成都科龍試劑廠；AF(B1、B2、G1和G2)和OTA標準品北京泰樂祺公司；高純氮氣 重慶嘉潤氣體有限公司；超純水。

LC-20A高效液相色譜儀(配有可變波長熒光檢測器)日本島津公司；JY2002分析天平(精度到0.0001g) 上海精密科學儀器有限公司天平儀器廠；KQ-50超聲清洗器昆山超聲儀器有限公司；HQ-60漩渦振蕩器 北方同正生物技術發展公司；SG-280萬能高速粉碎機 天津達康公司；HGC-12A氮吹儀 南京科捷分析儀器廠；JSG22 ×12標準篩 杭州大吉光電儀器有限公司；TC-M160 AFT多功能凈化柱、OTA-A01免疫親和柱 北京泰樂祺公司；Milli-QA10System超純水儀 Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 同時檢測方法

1.2.1.1 標準溶液的配制

分別稱取0.0010g AFB1、AFB2、AFG1、AFG2和OTA溶于1mL乙腈中，配制成各自質量濃度為106μg/L的標準儲備液，密封后避光保存。用標準儲備液逐級稀釋成標準系列溶液，制作標準曲線。

1.2.1.2 色譜條件

色譜柱：安捷倫ZORBAX SB-C18色譜柱，4.6mm ×250mm；流動相A：2%冰醋酸-乙腈70:30(V/V)；流動相B：2%冰醋酸-乙腈 50:50(V/V)；流速：1mL/min；柱溫：30℃；進樣量：10μL；梯度洗脫程序見表1。

表1 液相梯度洗脫條件Table 1 Elution conditions of HPLC

1.2.1.3 提取與凈化

樣品粉碎，過20目篩，準確稱取5g樣品于50mL三角瓶中，加入20mL甲醇-水(80:20，V/V)，室溫超聲提取20min，定量濾紙過濾至三角瓶中，準確移取濾液5mL于試管中，加入5mL三氯甲烷，振蕩1min，靜置分層，將上層濾液移入另一試管中，向其加入1mL三氯甲烷，振蕩1min，靜置分層，棄去上層水層，將三氯甲烷層倒入第一支試管中，合并兩次萃取液。

1.2.1.4 衍生

將收集到的萃取液(60±1)℃水浴氮氣吹干，加入200μL正己烷和100μL三氟乙酸，密閉混勻30s，(40± 1)℃烘干箱中衍生15min，室溫水浴氮氣吹干，用1mL流動相溶解，0.22μm有機濾膜過濾，液相色譜測定。

1.2.2AFT國家標準檢測方法

參照GB/T 5009.23—2006《食品中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的測定》[17]方法檢測。

1.2.3 OTA國家標準檢測方法

參照GB/T 23502—2009《食品中赭曲霉毒素A的測定：免疫親和層析凈化高效液相色譜法》[18]方法檢測。

2 結果與分析

2.1 提取凈化條件的選擇

2.1.1 提取方式對毒素提取效果的影響

圖1 提取方式對毒素回收率影響Fig.1 Effect of extraction method on recovery rates of mycotoxins

實驗比較超聲波和漩渦振蕩及兩者交替3種方式對提取效果的影響，3種方式對毒素的提取回收率影響見圖1。結果表明超聲波提取效果比漩渦振蕩效果好，各種毒素的回收率均在80%以上，而漩渦提取回收率不到70%，超聲與漩渦交替與直接超聲提取結果無顯著差異。

在食品原料中，毒素在食品中的分布非常不均勻，毒素并不集中在樣品顆粒表面，而是常常包埋在種子內部，并且與某些成分結合在一起，加之含量甚微，所以采用普通的機械振蕩處理很難提取完全，而超聲波提取技術主要通過快速機械振動波來減少目標萃取物與樣品基體之間的作用力從而實現固-液萃取分離，從而使固體樣品分散，被提取的樣品細胞在瞬間破碎，同時改變細胞壁的結構，從而加強了毒素的溶解及擴散，增大樣品與萃取溶劑之間的接觸面積，提高目標物從固相轉移到液相的傳質速率，所以有利于毒素的提取完全。故采用超聲波作為提取方式。

2.1.2 提取溶劑對毒素提取效果的影響

分別以甲醇-水(90:10；80:20；70:30，V/V)和乙腈-水(90:10；80:20；70:30，V/V)為提取劑對樣品進行提取，結果表明，以甲醇-水(80:20，V/V)和乙腈-水(80: 20，V/V)的提取效率最高，回收率均大于85%，提取結果見圖2。

圖2 提取劑比例對毒素回收率的影響Fig.2 Effect of solvent amount on recovery rates of mycotoxins

AFT和OTA易溶于帶極性的溶劑而不溶于非極性溶劑中，一般使用幾種有機溶劑的混合液，如甲醇、乙睛、丙酮、氯仿等作為提取液。提取液中少量水可以濕潤基質，增強有機溶劑在樣品中的滲透能力，提高萃取效率，因此，通常采用有機溶劑與水的混合溶液作提取劑，例如，氯仿-水、甲醇-水或乙睛-水等；實驗結果表明80%甲醇溶液和80%乙腈溶液對提取效果影響無顯著差異，考慮到甲醇的潛在毒性相對較低且價格便宜，因此最終選擇以甲醇-水(80:20，V/V)作為提取劑。

2.1.3 提取時間對毒素提取效果的影響

研究提取時間(10、20、30min)對提取率的影響，當提取時間10min時各種毒素回收率較低，當提取時間達20min以上時，回收率顯著升高，20min和30min對提取效果無顯著差異，結果見圖3。

圖3 提取時間對毒素回收率的影響Fig.3 Effect of extraction time on recovery rates of mycotoxins

隨超聲波提取時間的延長，提取率增大。分析原因是毒素在甲醇-水溶液中擴散逐漸均勻，隨著時間延長而達到最大溶解度；但是提取時間過度延長，使雜質的溶出量增加，使毒素的檢測受到干擾，另一方面成本費用增大，影響環保，因此提取時間確定為20min。

2.1.4 萃取次數對毒素提取效果的影響

研究萃取次數(1、2次和3次)對回收率的影響，發現當萃取次數達2次以上時提取效果較好，回收率均大于80%，結果見圖4。

圖4 萃取次數對毒素回收率的影響Fig.4 Effect of extraction repeat number on recovery rates of mycotoxins

AFT和OTA易溶于甲醇、三氯甲烷等有機溶劑，當用三氯甲烷萃取1次時仍有少量毒素殘留水相中，回收率低，當萃取2次后回收率顯著升高，毒素已基本萃取完全，萃取2次和萃取3次結果無顯著差異，因此最終選擇萃取2次。

2.1.5 提取溫度、功率和料液比對毒素提取效果的影響

研究溫度(40、30、20℃)、功率(100、120、150W)、料液比1:4、1:5、1:6(g/mL)對提取效果的影響，發現三者對提取率的影響不顯著，本著經濟和環保的原則最終選擇20℃、100W和料液比1:4(g/mL)作為提取條件。

2.2 線性范圍及檢出限

分別用AFB1、AFG1、AFB2、AFG2和OTA的系列標準溶液按選定的色譜條件測定，其質量濃度(y)與峰面積(x)具有良好的線性關系，結果見表2。根據3倍信噪比的峰響應值，得出此方法檢出限。

表2 真菌毒素的線性回歸方程及檢出限Table 2 Regression equations and detection limits of mycotoxins

2.3 精密度實驗

分別用同一批樣品做了日內和日間7次精密度實驗，日內不同時間段分別處理7個樣品，日間連續7d每天處理一個樣品，實驗結果見表3。日內和日間實驗都表明精密度良好，說明方法重現性好。

表3 精密度實驗結果Table 3 Result of precision experiments

2.4 回收率實驗

在玉米、大米和小麥中添加表4中所列的3組不同水平的真菌毒素，按上述實驗條件進行回收實驗，測得的回收率見表4。標準溶液及加標樣品的色譜圖見圖5～8。

表4 回收率實驗結果Table 4 Results of recovery experiments

圖6 玉米樣品液相色譜圖Fig.6 Chromatogram of corn sample

圖7 大米樣品液相色譜圖Fig.7 Chromatogram of rice sample

表6 本方法與國標方法比較Table 6 Comparison of the simultaneous determination method with current national standard method

圖8 小麥樣品液相色譜圖Fig.8 Chromatogram of wheat sample

2.5 方法學驗證

將所建立的AFT和OTA 5種主要真菌毒素同時檢測方法與AFT、OTA單一毒素國標檢測方法進行比對，同一批樣每種方法平行測定3次，比對結果見表5。

表5 與國標對比實驗結果Table 5 Comparison of experimental results with current national standard

本方法在試劑使用、時間、成本及檢出限等方面都滿足現行國標要求，比較結果見表6。

從表6可以看出，AFT和OTA的同時檢測可以節約時間，降低成本，減少工作量，避免試劑的重復使用，檢出限滿足國家檢測標準要求，適用于糧食作物中AFT和OTA的測定。

3 結 論

本研究結果表明采用三氟乙酸柱前衍生-高效液相色譜能夠同時檢測AFT和OTA，且建立的同時檢測方法與兩者單獨國標檢測方法檢測結果無顯著差異，該方法成本較低，操作簡便、快速、凈化效果好，各項技術指標均符合真菌毒素國家檢測標準的要求，可以滿足我國對糧食中AFT和OTA的限量檢測要求。

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Simultaneous Determination of Aflatoxins and Ochratoxin A in Cereal Grains by High Performance Liquid Chromatography

YANG Lin1，ZHANG Yu-hao1,2，MA Liang1,2,*
(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China；2. Chongqing Special Food Engineering Technology Research Center, Chongqing 400715, China)

A HPLC method was developed for the simultaneous determination of aflatoxins B1, B2, G1 and G2 and ochratoxin A in cereal grains. Cereal grain samples were subject to extraction using methano1-water (80:20, V/V), liquid-liquid purification, enrichment and derivation using trifluoroacetic acid. The purification was performed on an Agilent ZORBAX SB-C18column (4.6 mm × 250 mm) with a linear gradient elution of acetonitrile-2% glacial acetic acid. The detection limits of developed HPLC method for AFB1, AFB2, AFG1, AFG2 and OTA were 0.06, 0.03, 0.18, 0.05μg/kg and 0.51μg/kg, respectively. The linear detection ranges of developed HPLC method for AFB1, AFB2, AFG1, AFG2and OTA was 0.05-100, 0.125-25.00, 0.05-100, 0.125-25.00μg/L and 0.05-50.00μg/L with correlation coefficients of 0.9998, 0.9998, 0.9998, 0.9996 and 0.9998, respectively. Recovery rates in cereal grains (corn, rice, wheat) spiked with mycotoxins were in the range of 71.73%-115.37% with the relative standard deviation of 3.00%-9.88%. This HPLC method exhibited the capability to simultaneously determinate mycotoxins. Moreover, no significant difference was observed between the determination results and current national standard (P＞0.05).

high performance liquid chromatography；mycotoxins；simultaneous determination；cereal grain

TS207.3

A

1002-6630(2010)24-0250-05

2010-09-20

國家“863”計劃項目(2007AA10Z427)；重慶市科技攻關計劃項目(CSTC，2009AC0008)；中央高?；究蒲袠I務費專項(XDJK 2009C056)；重慶市高等教育教學改革研究項目(09-3-183)；西南大學“518”質量工程項目(2008JY069)

楊琳(1984—)，女，碩士研究生，研究方向為食品安全與質量控制。E-mail：swuyanglin@yahoo.com.cn

*通信作者：馬良(1979—)，女，副教授，博士，研究方向為食品安全檢測技術與食品質量控制。E-mail：zhyhml@163.com