應用AFLP技術鑒別不同地區的普洱茶曬青毛茶

季鵬章，呂才有，梁名志，張 俊，黃興奇

(1.云南省農業科學院茶葉研究所，云南 昆明 650203；2.云南省農業科學院生物技術與種質資源研究所，云南 昆明 650203；3.云南農業大學普洱茶學院，云南 昆明 650201)

應用AFLP技術鑒別不同地區的普洱茶曬青毛茶

季鵬章1,2，呂才有3，梁名志1，張 俊1，黃興奇2

(1.云南省農業科學院茶葉研究所，云南 昆明 650203；2.云南省農業科學院生物技術與種質資源研究所，云南 昆明 650203；3.云南農業大學普洱茶學院，云南 昆明 650201)

為鑒別不同地區的普洱茶曬青毛茶，對31個來自不同地區的普洱茶曬青毛茶進行AFLP-毛細管電泳技術分析，一共得到426個可重復的位點，多態位點百分率為94.6%，聚類分析主要分為臺地茶類、老樹茶類等兩大類。結果表明，采用以下方法可鑒別不同來源的普洱茶曬青毛茶：從典型的主要特征峰和染色信號的最高值和次高值來區別；從峰形圖的整個形狀來區分；與對照的峰形圖比較來區分。表明AFLP-毛細管電泳技術是一種高效的分子標記技術，能成功應用于不同區域普洱茶曬青毛茶的鑒別。

普洱茶；曬青毛茶；AFLP

普洱茶是以云南大葉種茶樹的鮮葉經殺青、揉捻、日曬等工序制成的曬青毛茶為原料，再經發酵、蒸揉、成型制成各種形狀的成品普洱茶[1]。曬青毛茶是普洱茶特異品質的物質基礎。普洱茶有“青餅”和“熟普”之分，以曬青毛茶為原料，壓制成“青餅”，目前市場流通中交易常稱為“生普”(生茶)，是普洱茶的歷史原形；“熟普”(熟茶)是“生普”在后期經渥堆后發酵所形成的品質獨特的一類茶葉[2]。普洱茶因其獨特品質和保健功效，產業發展十分迅速。用著名古茶園所產鮮葉制作的老樹茶曬青，品質優于用臺地茶園所產鮮葉制作的臺地茶曬青，價格居高不下；但古茶園曬青產量有限，導致了假冒著名老樹茶的大量出現。與此同時，市場上出現了部分用中小葉種、大理茶等非云南大葉種鮮葉制作的假冒“普洱茶”曬青，嚴重影響了普洱茶的聲譽。老樹茶是指由百年以上的古茶園所產鮮葉加工而成的普洱茶，云南省現有古茶園4萬hm2；臺地茶是指采制于新中國成立后發展建立的密植條栽茶園，云南省現有該類茶園近20萬hm2。

曬青毛茶的鑒定目前主要依據感官審評、內含化學成分分析等方法，然而，上述方法存在分析費用高、標準不一致等問題。多種分子標記技術已成功應用于茶葉、茶樹的鑒別，如RAPD[3-4]、RFLP[5]、5S rRNA[6]、AFLP[7]。本實驗在收集云南不同區域的31份普洱茶曬青毛茶的基礎上，采用AFLP 毛細管電泳技術對其進行分析，旨在區分不同區域的老樹茶、區分老樹茶與臺地茶，為普洱茶原產地保護提供參考，促進普洱茶的持續健康發展。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

材料：共收集曬青毛茶樣本31個，包括普洱茶的主要原產地——云南省西雙版納州、普洱市、臨滄市等地的曬青毛茶。臨滄二嘎子茶經鑒定為大理茶種(Camellia taliensis大理茶)、佛香茶為中小葉種(C. sinensis var. sinensis茶)，其余樣本都是云南大葉種(C. sinensis var. assamica阿薩姆茶)所制曬青毛茶(表1)。

表1 普洱茶曬青毛茶來源Table 1 Sun-dried tea samples in this study

Taq酶、MgCl2、10×PCR buffer Fermentas MBI公司；EcoRI酶、MseI酶、T4連接酶試劑盒 日本Toyobo公司；瓊脂糖 西班牙Pharmacia公司。

CEQ8000遺傳分析系統 美國貝克曼庫爾特公司；5415R離心機 德國 Eppendorf 公司；PTC-200型PCR儀 美國MJ公司。

1.2 DNA的提取和AFLP-PCR的擴增

采用改進的CTAB法[8]，用于正式擴增的樣品都用RNA酶A進行純化。純化后的DNA用紫外分光光度計測定260nm和280nm波長處的光密度值。用于PCR反應的總DNA濃度稀釋到200ng/μL。擴增反應參照文獻[9]。

1.3 AFLP-毛細管電泳

整個流程在遺傳分析系統上完成，采用熒光標記技術和毛細管電泳分離技術，擴增產物在高分辨率毛細管中電泳分離，激光激發熒光采集數據，電泳結果通過軟件自動統計分析并轉化為“0、1”矩陣備用，同時導出電泳分離圖譜。

1.4 數據處理和分析

輸入得到的0、1矩陣，用NTSYSpc 2.0[10]對除M1～M8之外的M9～M19、P1～P5、L1～L7等23個樣本進行UPGMA聚類分析。同時分析31個樣本的電泳分離圖譜。

2 結果與分析

2.1AFLP引物組合的擴增結果

兩對選中的AFLP引物共擴增出可重復的426條帶，檢測出403個多態性(P=94.6%)，平均每對引物擴增的總帶數為213條，多態性條帶201.5。引物E-AAC/ M-CTG的P=94.62%，引物E-AAC/M-CTA的P=94.58% (表2)。

表2 所用引物組合及其檢測效率Table 2 Primers used in AFLP and their screening efficiency

2.2 聚類分析

圖1 23個曬青毛茶的UPGMA 聚類圖Fig.1 UPGMA dendrogram based on Jaccard similarities of 23 tea samples

根據Jaccard相似性系數[11]，對M9～M19、P1～P5、L1～L7等23個樣品進行UPGAM 聚類(圖1)，相似性系數在0.33左右時，可分為2個大的類群，5個小類群。第一個大類群由勐宋大安(M9)、紫芽(M12)、布朗山(M13)、孟連(P1)、臨滄1(L1)、螞蟻堆(L3)等6個樣品構成；第二個大類群由紫娟(M11)、曼邁(M14)、老茶樹(M15)、格朗和(M16)、老班章(M17)、巴達(M18)、勐混(M19)、普洱1(P2)、普洱2(P3)、臨滄2 (L2)、勐庫(L4)、黑條子茶(L7)等12個樣品構成；5個小類群分別是佛香(M10)、普洱餅(P4)、瀾滄大山(P5)、白鶯山(L5)和二嘎子茶(L6)。

2.3 AFLP-毛細管電泳圖譜分析

表3 31個曬青毛茶引物E-AAC/M-CTG的毛細管電泳圖譜主要峰值Table 3 Main peak values of 31 tea samples in AFLP fingerprint patterns using primer combination E-AAC/M-CTG

表4 31個曬青毛茶引物E-ACC/M-CTA的毛細管電泳圖譜主要峰值Table 4 Main peak values of 31 tea samples in AFLP fingerprint patterns using primer combination E-ACC/M-CTA

兩對31個AFLP-毛細管電泳圖譜都有一定的差異，見圖2和表3、4。引物E-AAC/M-CTG 則有明顯的差異，如二嘎子茶96、215特征峰，佛香茶的234特征峰，紫娟的83、198、200特征峰，勐庫茶的199、511特征峰，瀾滄大山的210特征峰；引物E-AAC/M-CTA的如白鶯山332特征峰等。此外，對于圖形比較類似的樣品，可以依據染色信號的最高值和次高值來進行比較，如勐海格朗和、老班章、巴達，引物E-AAC/MCTA 最高值都是337，但次高值分別為176、132、169。因而可成功地將三者區分出來。

3 討 論

3.123 個曬青毛茶的聚類分析

從聚類圖可以看出第一個大類群由勐宋、布朗山等6個樣品構成，6個樣品都為臺地茶，分析第一大類群由臺地茶構成。第二個大類群由老班章、勐混、巴達、曼邁、格朗和等12個樣品構成。這12個樣品中老班章、勐混、巴達、曼邁、格朗和、老茶樹、勐庫和黑條子茶等多數樣本為老樹茶，分析第二大類群主要由老樹茶構成。此外，5個小類群中，佛香茶(C. sinensis var. sinensis)、臨滄二嘎子茶(C. taliensis)與云南大葉種親緣關系較遠。而臨滄白鶯山則推測白鶯山是茶樹種質資源庫，生長有大理茶等其他茶組植物，白鶯山茶可能混雜有其他茶組植物的基因[12-13]，因而與大葉種親緣關系較遠。

3.2 曬青毛茶AFLP-毛細管電泳鑒別技術分析

陳亮等[3]應用RAPD標記對原產于云南等地的24份野生茶樹資源進行分子鑒定研究。結果表明，RAPD標記在鑒定茶樹種質資源方面非常有效。有3種獨立的方法可以用于茶樹種質資源的分子鑒定：特殊的標記；特異的譜帶類型；不同引物提供譜帶類型的組合。16個特異標記的存在和3個特異標記的缺失可以鑒定14份資源；Singh等[4]用從市場上購來的10個不同品牌的紅茶、綠茶，提取DNA，用RAPD鑒別，并認為該方法用來證明某著名品牌的茶葉的來源，有極大的應用性。Matsumoto等[5]用RFLP技術，以PAL基因為探針鑒別日本綠茶的遺傳差異，集合2種限制性內切酶，2.3kb的探針能從阿薩姆種茶中鑒別出日本綠茶。Dhiman等[6]報道從5S rRNA基因片段設計了種間的特異PCR探針，并成功地檢測到在茶葉樣品中摻雜的腰果殼。從上述報道可看出，分子標記在茶樹種質和產品鑒別是可行的。

本研究所用的AFLP-毛細管電泳技術，一對引物可擴增出200多個位點，位點差異在1bp都能檢測到，更容易檢測出材料的細微差異，同時采用高效自動化技術，降低了人為操作帶來的誤差，易于對擴增樣本進行標準化分析，提高了數據的可靠性。通過對31個曬青毛茶的AFLP分析，31個曬青毛茶的AFLP毛細管電泳圖譜都有差異，可以通過以下方法來區分不同地區的曬青毛茶、區分老樹茶與臺地茶：①從典型的主要特征峰和染色信號的最高值和次高值來區別，如勐庫茶的199、511特征峰和瀾滄大山的210特征峰；②從峰形圖的整個形狀來區分；③與對照的峰形圖比較來區分。此外，該技術還可以用于鑒別非云南大葉種加工的曬青毛茶，如本實驗中的佛香茶、二嘎子茶，二者與云南大葉種曬青的AFLP圖譜有明顯的區別。說明AFLP-毛細管電泳技術可用于普洱茶的真偽鑒別。

不同區域曬青毛茶的鑒別技術是非常復雜的，梁名志等[14]以云南省的古茶園和臺地茶園的蒸青茶、曬青茶為樣品，從感官審評、內含品質化學成分和礦物質元素檢測分析得出：老樹茶與臺地茶確有差異，但很難用感官審評、內含品質化學成分和礦物質元素檢測等方法來區分。云南普洱茶產地廣泛，本次研究用AFLP-毛細管電泳雖取得一定進展，但并沒有覆蓋所有普洱茶典型產地。今后要對普洱茶典型產地繼續開展AFLP-毛細管電泳分析，通過數據、圖譜的積累，形成一整套完整的不同古茶山的AFLP-毛細管電泳數據庫，應用于不同產地普洱茶曬青毛茶的鑒別。將更能發揮出AFLP-毛細管電泳技術的優勢，為云南普洱茶產業的健康發展服務。

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AFLP Fingerprinting for Identifying Geographical Origins of 31 Sun-dried Tea (Maocha) Samples

JI Peng-zhang1,2，LCai-you3，LIANG Ming-zhi1，ZHANG Jun1，HUANG Xing-qi2
(1. Institute of Tea Research, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Kunming 650203, China；2. Institute of Biotechnology and Genetic Germplasm, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Kunming 650203, China；3. College of Pu , er Tea, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China)

Amplified fragment length polymorphisms (AFLPs) markers were employed to identify the geographical origins of 31 sundried tea samples, which was a material for Pu , erh tea processing. A total of 420 polymorphic bands out of 426 reproducible products were amplified. Percentage of polymorphic loci (P) was 94.6%. Dendrogram generated after UPGMA clustering by NTSYS software indicated that 31 samples could be divided into conventional and ancient tea type. There were three methods to identify ancient tea and conventional tea, and to discriminate ancient tea from other geographical origins using AFLP marker: (1) based on the main peak value and the highest and second highest value of dye signal of tea samples. (2) based on the whole AFLP diagram of different samples. (3) cmpare target tea AFLP diagram with control tea group AFLP diagram. The result showed that AFLP marker was an effective tool and a robust method in discrimination of sun-dried tea (Maocha).

Pu , erh tea；sun-dried tea；amplified fragment length polymorphism (AFLP)

TS272.5

A

1002-6630(2010)24-0264-04

2010-08-19

“十一五”國家科技支撐計劃項目(2007BAD58B06)；云南省應用基礎研究計劃重點項目(2006C0012Z)

季鵬章(1975—)，男，副研究員，博士，研究方向為茶樹種質資源與遺傳改良。E-mail：pengzhji@126.com