雙抗夾心ELISA方法檢測食品中單核細胞增生李斯特氏菌

段 霞，黃 欣，黃嶺芳，魏 華，賴衛華,*

(1.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.南昌市西湖區疾病預防控制中心，江西 南昌 330025)

雙抗夾心ELISA方法檢測食品中單核細胞增生李斯特氏菌

段 霞1，黃 欣2，黃嶺芳1，魏 華1，賴衛華1,*

(1.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.南昌市西湖區疾病預防控制中心，江西 南昌 330025)

采用0.5%福爾馬林滅活的單核細胞增生李斯特氏菌作為免疫原免疫日本大耳兔，獲得抗單核細胞增生李斯特氏菌多克隆抗體，并以此多克隆抗體作為捕獲抗體，以抗單核細胞增生李斯特氏菌Internalin A(InlA)單克隆抗體作為檢測抗體，建立快速、特異的檢測該菌的雙抗夾心ELISA方法。結果表明：該方法對單核細胞增生李斯特氏菌純培養液的最低檢測量為1.7×105CFU/mL。在檢測食品樣品的實驗中，食品樣本對本方法干擾較小，運用選擇性增菌液進行前增菌可提高該方法的準確性。

單核細胞增生李斯特氏菌；多克隆抗體；單克隆抗體；雙抗夾心ELISA方法

單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes，LM)是李斯特氏菌屬(Listeria)中唯一能引起食物中毒的菌。該菌為革蘭氏陽性短桿菌，無芽孢和莢膜，有鞭毛，需氧或兼性厭氧菌[1-2]。該菌可在比較極端的條件下生長，例如生長溫度范圍-1.5～50℃、pH4.3～9.6，可耐受較高鹽濃度。LM同時可以耐受低溫和低水分的特性，導致了其在食品中的廣泛傳播。感染LM可引起單核細胞增多、腦膜炎、敗血癥和流產。孕婦、新生兒、老年人和免疫缺陷病人[3-4]為易感人群。食源性李斯特氏菌發病率雖不高，但死亡率有時可達20%～50%，對食品安全及人類健康造成了極大的威脅。

LM在2000年已被世界衛生組織(WHO)食品安全工作計劃列為重點檢測的食源性致病菌之一。1999年底美國密歇根州和2008年8月加拿大均因LM污染肉類食品而導致了嚴重的集體食物中毒事件。歐洲地區僅2006年LM感染確診病例就達1583例[5]。在我國尚未有LM引起大規模食物中毒的報道，但食品中LM污染情況還是較為嚴重。傅宜方等[6]對廣州市市售的112份熟肉制品樣品進行LM檢測，LM檢出率高達8.04%；龍巖市[7]、江門市[8]、馬鞍山市[9]等城市的食品也受到不同程度的LM污染。因此建立靈敏且特異性高的檢測方法用于食品中該菌的檢測尤為重要。

ELISA方法是一種敏感性高、特異性強、重復性好的實驗診斷方法。將抗原、抗體免疫反應的特異性和酶的高效催化作用原理有機地結合起來，可敏感地檢測樣品中微量的特異性抗原。本研究擬建立檢測LM雙抗夾心ELISA方法，并對該方法進行靈敏度和特異性評價。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

單核細胞增生李斯特氏菌CMCC 54007(Listeria monocytogenes CMCC 54007) 中國醫學細菌保藏管理中心；單核細胞增生李斯特氏菌CMCC 54001(Listeria monocytogenes CMCC 54001)、綿羊李斯特氏菌 1.1476 (Listeria ivanovii 1.1476)、大腸埃希氏菌O157:H7 CMCC 44828(Escherichia coli O157:H7 CMCC 44828)、大腸埃希氏菌CMCC 44496(Escherichia coli CMCC 44496)、大腸埃希氏菌CMCC 44350(Escherichia coli CMCC 44350)、大腸埃希氏菌CMCC 44102(Escherichia coli CMCC 44102)、大腸埃希氏菌2DBE2001(Escherichia coli 2DBE2001)、金黃色葡萄球菌CMCC 26001(Staphylococcus aureus CMCC 26001)、金黃色葡萄球菌CMCC 26002(Staphylococcus aureus CMCC 26002)、金黃色葡萄球菌CMCC 26003 (Staphylococcus aureus CMCC 26003)、阪崎腸桿菌CMCC 45401(Enterobacter sakazakii CMCC 45401)、阪崎腸桿菌CMCC 45402(Enterobacter sakazakii CMCC 45402)、鼠傷寒沙門氏菌 ATCC13311(Salmonella typhimurium ATCC 13311)、福氏志賀氏菌2457(Shigella flexneri 2457)、福氏志賀氏菌301(Shigella flexneri 301)、藤黃微球菌 CMCC 28003(Micrococcus luteus CMCC 28003)、白色假絲酵母Z1(Candida albicans Z1)、枯草芽孢桿菌168(Bacillus subtilis 168)、枯草芽孢桿菌BD366(Bacillus subtilis BD366)、副溶血弧菌CGMCC 1.1997(Vibrio parahemolyticus CGMCC 1.1997)、副溶血弧菌CGMCC 1.1616(Vibrio parahemolyticus CGMCC 1.1616)均為本實驗室保存。

LB肉湯培養基 杭州百思生物技術有限公司；BLEB增菌肉湯 北京陸橋技術有限公司；Tween-20 天津永大化學試劑開發中心；辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG、羊抗兔IgG Sigma公司；TMB顯色液 北京科衛臨床診斷試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

DNM-9602型酶標分析儀 北京朗普新技術有限公司；BHC-1300ⅡA/B3型生物安全柜 蘇州蘇凈集團安泰公司；ZDP-A2160型電熱恒溫箱、2HWY-21029型恒溫培養振蕩器 上海智誠分析儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫抗原及檢測菌液的制備

將甘油管保存的菌株LM CMCC 54007(LM 54007)復蘇后，轉接于200mL LB中，37℃振蕩培養20h，4300 r/min離心收集菌體，0.01mol/L、pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌兩次后加入含0.5%福爾馬林的PBS 30mL[10]，室溫作用24h滅活菌體，然后離心收集菌體，PBS洗滌兩次后重懸，分裝-20℃保存備用。

1.3.2 抗LM多克隆抗體的制備

雌性日本大耳兔(2.0kg左右)2只，進行皮下多點免疫，免疫原體積為0.5mL/只。首次免疫抗原量約為2× 109CFU/只。之后進行4次追加免疫，免疫周期為兩周，免疫量為4×109～3.2×1010CFU/只[11]。每次免疫前和免疫1周后耳緣靜脈采血，間接ELISA方法測定效價[12-13]，效價達到105后停止免疫，并在最后一次免疫1周后股動脈采血。獲得的抗血清采用辛酸-硫酸銨法純化[14]，測定純化后的抗血清的效價。

1.3.3 雙抗夾心ELISA方法的建立

以純化后的多克隆抗體作為捕獲抗體，以本實驗室已經制備的抗LM Internalin A單克隆抗體3R6[15]為檢測抗體，建立雙抗夾心ELISA方法[16-17]。具體步驟如下：

抗體、抗原和BSA稀釋液均為0.01mol/L、pH7.4 PBS。洗板液為含0.1% Tween-20的0.01 mol/L、pH7.4 PBS(PBST)。結果判定：以(測定孔OD值-空白對照孔OD值)/(陰性對照孔OD值-空白對照孔OD值)≥2.1(即P/N≥2.1)時判斷為陽性。

1.3.4 棋盤滴定法確定多克隆抗體和單克隆抗體工作濃度

本實驗采用棋盤滴定法確定雙抗夾心ELISA方法中多克隆抗體和單克隆抗體適宜的工作濃度。多克隆抗體作為捕獲抗體從5000倍倍比稀釋至3.2×105倍。單克隆抗體作為檢測抗體從400倍倍比稀釋至12800倍。同時陰性血清也由400倍稀釋至12800倍作為陰性對照，每個多克隆抗體的稀釋度都用PBS作為空白對照[18]。ELISA操作步驟同1.3.3節。

1.3.5 雙抗夾心ELISA方法靈敏度和特異性的判斷

將37℃振蕩培養20h的LM 54007純培養液，平板計數后經系列稀釋后作為待檢菌液加入雙抗夾心ELISA體系中，檢測該方法的靈敏度；用LM 54007和綿羊李斯特氏菌、E.coli O157:H7 44828、福氏志賀氏菌301、金黃色葡萄球菌 26003、阪崎腸桿菌 45401等實驗室保存21株菌株的新鮮純培養液檢測雙抗夾心方法的特異性。檢測菌液的菌濃度均為1.0×108CFU/mL。

1.3.6 食品樣本檢測實驗

本實驗選取市售消毒牛奶、生菜、牛肉、果汁接種目的菌(LM 54007)和非目的菌(金黃色葡萄球菌26003、鼠傷寒沙門氏菌13311、福氏志賀氏菌301、E.coli O157: H7 44828和阪崎腸桿菌45401)。經過前增菌后，作為檢測菌液加入本檢測系統，以檢測食品樣品對于本系統的敏感性和準確性的影響。

目的菌的準備：LM 54007用LB培養基，37℃振蕩培養20h后，用生理鹽水稀釋105倍。非目的菌的準備：金黃色葡萄球菌26003、鼠傷寒沙門氏菌13311、福氏志賀氏菌301、E.coli O157:H7 44828和阪崎腸桿菌45401用LB培養，37℃振蕩培養8h后，用生理鹽水稀釋105倍。同時對這6株菌培養液進行活菌計數。之后，目的菌和5株非目的菌各取1mL混合，標記為A菌液。另外將5株非目的菌各取1mL混合，標記為B菌液。

食品樣本的處理：將市售牛肉樣本研磨成肉糜，每份25g，共4份。稱取50g生菜，加入50mL PBS榨汁，每份25mL，共4份。對于消毒牛奶和果汁分別取4份，每份25mL。

每種食品樣本做4組實驗，分別為BLEB增菌液添加A菌液組、BLEB增菌液添加B菌液組和LB增菌液添加A菌液組、LB增菌液添加A菌液組。首先取220mL增菌液、25g(25mL)樣品(樣品液)和5mL菌液，混勻后進行增菌。BLEB增菌液實驗組在30℃預增菌4h，之后向增菌液中加入配套選擇性試劑(吖啶黃、萘啶酮酸、放線菌酮)后30℃繼續培養[19]。LB增菌液實驗組在37℃培養。分別在增菌16h和24h，取增菌液進行雙抗夾心ELISA實驗。同時各增菌液經系列稀釋后涂布于OXA瓊脂平板(LM典型菌落在平板上呈現黑色并帶有黑色暈圈)，37℃培養24h后觀察結果，以判定雙抗夾心ELISA方法的準確性。

2 結果與分析

2.1 多克隆抗體效價

經飽和辛酸-硫酸銨法純化的多克隆抗體，用間接ELISA方法測定其效價。由圖1可知多克隆抗體的效價約為3.2×105。

圖1 多克隆抗體效價曲線Fig.1 Titer cure of polyclonal antibody

2.2 多克隆抗體和單克隆抗體工作濃度的確定

表1 棋盤滴定法確定多克隆抗體和單克隆抗體稀釋倍數Table 1 Determination of poly- and mono-clonal antibody working concentration by chessboard titration

表2 雙抗夾心ELISA檢測靈敏度實驗結果Table 2 Sensitivity of double-antibody sandwich ELISA

由表1可以看出，當多克隆抗體抗體稀釋10000倍作為捕獲抗體時，單克隆抗體稀釋800倍和1600倍的OD450值均在1.0左右，稀釋800倍的P/N值較稀釋1600倍大，因此選擇多克隆抗體稀釋10000倍，單克隆抗體稀釋800倍為最終工作濃度。

2.3 雙抗夾心ELISA方法的靈敏度

經過平板計數，新鮮LM 54007純培養液的菌濃度約為3.4×108CFU/mL。LM 54007純培養液經梯度稀釋后作為檢測菌液測定本方法的靈敏度。如表2所示，本方法的檢測限約為1.7×105CFU/mL。

2.4 雙抗夾心ELISA方法的特異性

用LM 54007和實驗保存的LM 54001等21株菌檢測雙抗夾心ELISA法的特異性。結果顯示，本方法與LM 54001有強烈的交叉反應，說明本方法可以檢測到不同血清型的LM。與綿羊李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌26003和阪崎腸桿菌45401有輕微的交叉反應。其余的17株菌均無交叉反應。

表3 雙抗夾心ELISA方法特異性實驗結果Table 3 Specificity of double-antibody sandwich ELISA

2.5 食品樣本檢測實驗

表4 雙抗夾心ELISA方法特異性檢測食品樣本實驗結果Table 4 Detection of Listeria monocytogenes in food samples by double-antibody sandwich ELISA

通過平板計數，可推斷出最終接種于增菌液中的目的菌LM 54007的濃度約為10CFU/mL。用雙抗夾心ELISA方法檢測在不同增菌條件下的增菌液，通過測定OD值進行判定。最終結果顯示添加有目的菌的BLEB增菌液和LB增菌液在增菌16h時就完全可以到達檢測限，檢測結果為強陽性。沒有添加目的菌的BLEB增菌液，結果判定為陰性。4種食品樣本用無選擇性的LB增菌液增菌后的OD值均比選擇性BLEB增菌液的略高。BLEB增菌液組的ELISA結果與OXA平板計數結果均一致，而沒有添加目的菌的LB增菌液ELISA結果與平板計數結果對比后，存在假陽性結果。

3 討 論

本實驗以福爾馬林滅活的LM 54007免疫日本大耳兔，獲得了抗LM 54007的多克隆抗體。多克隆抗體經辛酸-硫酸銨法純化后的效價可達3.2×105。以此多克隆抗體作為捕獲抗體，以實驗室已制備的抗LM Internalin A單克隆抗體作為檢測抗體，建立了雙抗夾心ELISA方法。該方法對于LM 54007純培養液的檢測限約為1.7×105CFU/mL，可以和另一株不同血清型的LM有強烈的交叉反應。

實際食品樣本中LM的存在量往往較少，無法達到檢測限的要求。因此，對檢測樣品來說，進行前增菌是必要的。本實驗中采用FDA增菌方法，以具有選擇性的BLEB增菌液進行前增菌。結果顯示，通過選擇性前增菌16h可以使樣品中的LM達到ELISA方法的檢測限。LB增菌液的OD值較高和假陽性結果可能是由于能夠引起交叉反應的金黃色葡萄球菌等菌可在沒有選擇性的LB增菌液充分生長導致的。LM在選擇性增菌液中生長良好，但選擇性試劑可抑制革蘭氏陰性菌和金黃色葡萄球菌等陽性菌的生長，從而能夠減弱與金黃色葡萄球菌等的交叉反應，降低假陽性率。本研究建立的方法用于實際樣本LM污染的篩查，可在48h內報告結果(包括前增菌)，比國標[20]等傳統檢測方法省時省力。本方法對設備要求較低，結果準確性較高，具有一定的應用前景。

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Detection of Listeria monocytogenes in Food by Sandwich ELISA

DUAN Xia1，HUANG Xin2，HUANG Ling-fang1，WEI Hua1，LAI Wei-hua1,*
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China；2. Nanchang Xihu District Center for Disease Control and Prevention, Nanchang 330025, China)

A rapid, specific and sensitive sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was developed to detect L. monocytogenes in food samples, which using polyclonal antibody as the capture antibody and anti-Internalin monoclonal antibody as the detection antibody. Anti-Listeria monocytogenes polyclonal antibody was prepared by using 0.5% formalin inactivated L. monocytogenes as antigen and Japanese rabbits as the host animal. The detection limit was 1.7×105CFU/mL in pure culture. Results showed that food samples had limited interference to the detection, while pre-enrichment using selective enrichment broth could significantly increase the detection limit and sensitivity.

Listeria monocytogenes；polyclonal antibody；monoclonal antibody；double-antibody sandwich ELISA

TS207.3

A

1002-6630(2010)24-0272-05

2010-08-07

科技部中小企業創新基金項目(10C26223601934)

段霞(1985—)，女，碩士研究生，研究方向為食品科學。E-mail：huaxiady666@126.com

*通信作者：賴衛華(1968—)，男，教授，博士，研究方向為食品科學。E-mail：talktolaiwh@163.com