雙抗夾心ELISA方法檢測(cè)食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌

段 霞，黃 欣，黃嶺芳，魏 華，賴衛(wèi)華,*

(1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；2.南昌市西湖區(qū)疾病預(yù)防控制中心，江西 南昌 330025)

雙抗夾心ELISA方法檢測(cè)食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌

段 霞1，黃 欣2，黃嶺芳1，魏 華1，賴衛(wèi)華1,*

(1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；2.南昌市西湖區(qū)疾病預(yù)防控制中心，江西 南昌 330025)

采用0.5%福爾馬林滅活的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌作為免疫原免疫日本大耳兔，獲得抗單核細(xì)胞增生李斯特氏菌多克隆抗體，并以此多克隆抗體作為捕獲抗體，以抗單核細(xì)胞增生李斯特氏菌Internalin A(InlA)單克隆抗體作為檢測(cè)抗體，建立快速、特異的檢測(cè)該菌的雙抗夾心ELISA方法。結(jié)果表明：該方法對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌純培養(yǎng)液的最低檢測(cè)量為1.7×105CFU/mL。在檢測(cè)食品樣品的實(shí)驗(yàn)中，食品樣本對(duì)本方法干擾較小，運(yùn)用選擇性增菌液進(jìn)行前增菌可提高該方法的準(zhǔn)確性。

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌；多克隆抗體；單克隆抗體；雙抗夾心ELISA方法

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes，LM)是李斯特氏菌屬(Listeria)中唯一能引起食物中毒的菌。該菌為革蘭氏陽(yáng)性短桿菌，無(wú)芽孢和莢膜，有鞭毛，需氧或兼性厭氧菌[1-2]。該菌可在比較極端的條件下生長(zhǎng)，例如生長(zhǎng)溫度范圍-1.5～50℃、pH4.3～9.6，可耐受較高鹽濃度。LM同時(shí)可以耐受低溫和低水分的特性，導(dǎo)致了其在食品中的廣泛傳播。感染LM可引起單核細(xì)胞增多、腦膜炎、敗血癥和流產(chǎn)。孕婦、新生兒、老年人和免疫缺陷病人[3-4]為易感人群。食源性李斯特氏菌發(fā)病率雖不高，但死亡率有時(shí)可達(dá)20%～50%，對(duì)食品安全及人類健康造成了極大的威脅。

LM在2000年已被世界衛(wèi)生組織(WHO)食品安全工作計(jì)劃列為重點(diǎn)檢測(cè)的食源性致病菌之一。1999年底美國(guó)密歇根州和2008年8月加拿大均因LM污染肉類食品而導(dǎo)致了嚴(yán)重的集體食物中毒事件。歐洲地區(qū)僅2006年LM感染確診病例就達(dá)1583例[5]。在我國(guó)尚未有LM引起大規(guī)模食物中毒的報(bào)道，但食品中LM污染情況還是較為嚴(yán)重。傅宜方等[6]對(duì)廣州市市售的112份熟肉制品樣品進(jìn)行LM檢測(cè)，LM檢出率高達(dá)8.04%；龍巖市[7]、江門(mén)市[8]、馬鞍山市[9]等城市的食品也受到不同程度的LM污染。因此建立靈敏且特異性高的檢測(cè)方法用于食品中該菌的檢測(cè)尤為重要。

ELISA方法是一種敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好的實(shí)驗(yàn)診斷方法。將抗原、抗體免疫反應(yīng)的特異性和酶的高效催化作用原理有機(jī)地結(jié)合起來(lái)，可敏感地檢測(cè)樣品中微量的特異性抗原。本研究擬建立檢測(cè)LM雙抗夾心ELISA方法，并對(duì)該方法進(jìn)行靈敏度和特異性評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌CMCC 54007(Listeria monocytogenes CMCC 54007) 中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心；單核細(xì)胞增生李斯特氏菌CMCC 54001(Listeria monocytogenes CMCC 54001)、綿羊李斯特氏菌 1.1476 (Listeria ivanovii 1.1476)、大腸埃希氏菌O157:H7 CMCC 44828(Escherichia coli O157:H7 CMCC 44828)、大腸埃希氏菌CMCC 44496(Escherichia coli CMCC 44496)、大腸埃希氏菌CMCC 44350(Escherichia coli CMCC 44350)、大腸埃希氏菌CMCC 44102(Escherichia coli CMCC 44102)、大腸埃希氏菌2DBE2001(Escherichia coli 2DBE2001)、金黃色葡萄球菌CMCC 26001(Staphylococcus aureus CMCC 26001)、金黃色葡萄球菌CMCC 26002(Staphylococcus aureus CMCC 26002)、金黃色葡萄球菌CMCC 26003 (Staphylococcus aureus CMCC 26003)、阪崎腸桿菌CMCC 45401(Enterobacter sakazakii CMCC 45401)、阪崎腸桿菌CMCC 45402(Enterobacter sakazakii CMCC 45402)、鼠傷寒沙門(mén)氏菌 ATCC13311(Salmonella typhimurium ATCC 13311)、福氏志賀氏菌2457(Shigella flexneri 2457)、福氏志賀氏菌301(Shigella flexneri 301)、藤黃微球菌 CMCC 28003(Micrococcus luteus CMCC 28003)、白色假絲酵母Z1(Candida albicans Z1)、枯草芽孢桿菌168(Bacillus subtilis 168)、枯草芽孢桿菌BD366(Bacillus subtilis BD366)、副溶血弧菌CGMCC 1.1997(Vibrio parahemolyticus CGMCC 1.1997)、副溶血弧菌CGMCC 1.1616(Vibrio parahemolyticus CGMCC 1.1616)均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

LB肉湯培養(yǎng)基 杭州百思生物技術(shù)有限公司；BLEB增菌肉湯 北京陸橋技術(shù)有限公司；Tween-20 天津永大化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG、羊抗兔IgG Sigma公司；TMB顯色液 北京科衛(wèi)臨床診斷試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DNM-9602型酶標(biāo)分析儀 北京朗普新技術(shù)有限公司；BHC-1300ⅡA/B3型生物安全柜 蘇州蘇凈集團(tuán)安泰公司；ZDP-A2160型電熱恒溫箱、2HWY-21029型恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫抗原及檢測(cè)菌液的制備

將甘油管保存的菌株LM CMCC 54007(LM 54007)復(fù)蘇后，轉(zhuǎn)接于200mL LB中，37℃振蕩培養(yǎng)20h，4300 r/min離心收集菌體，0.01mol/L、pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌兩次后加入含0.5%福爾馬林的PBS 30mL[10]，室溫作用24h滅活菌體，然后離心收集菌體，PBS洗滌兩次后重懸，分裝-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 抗LM多克隆抗體的制備

雌性日本大耳兔(2.0kg左右)2只，進(jìn)行皮下多點(diǎn)免疫，免疫原體積為0.5mL/只。首次免疫抗原量約為2× 109CFU/只。之后進(jìn)行4次追加免疫，免疫周期為兩周，免疫量為4×109～3.2×1010CFU/只[11]。每次免疫前和免疫1周后耳緣靜脈采血，間接ELISA方法測(cè)定效價(jià)[12-13]，效價(jià)達(dá)到105后停止免疫，并在最后一次免疫1周后股動(dòng)脈采血。獲得的抗血清采用辛酸-硫酸銨法純化[14]，測(cè)定純化后的抗血清的效價(jià)。

1.3.3 雙抗夾心ELISA方法的建立

以純化后的多克隆抗體作為捕獲抗體，以本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)制備的抗LM Internalin A單克隆抗體3R6[15]為檢測(cè)抗體，建立雙抗夾心ELISA方法[16-17]。具體步驟如下：

抗體、抗原和BSA稀釋液均為0.01mol/L、pH7.4 PBS。洗板液為含0.1% Tween-20的0.01 mol/L、pH7.4 PBS(PBST)。結(jié)果判定：以(測(cè)定孔OD值-空白對(duì)照孔OD值)/(陰性對(duì)照孔OD值-空白對(duì)照孔OD值)≥2.1(即P/N≥2.1)時(shí)判斷為陽(yáng)性。

1.3.4 棋盤(pán)滴定法確定多克隆抗體和單克隆抗體工作濃度

本實(shí)驗(yàn)采用棋盤(pán)滴定法確定雙抗夾心ELISA方法中多克隆抗體和單克隆抗體適宜的工作濃度。多克隆抗體作為捕獲抗體從5000倍倍比稀釋至3.2×105倍。單克隆抗體作為檢測(cè)抗體從400倍倍比稀釋至12800倍。同時(shí)陰性血清也由400倍稀釋至12800倍作為陰性對(duì)照，每個(gè)多克隆抗體的稀釋度都用PBS作為空白對(duì)照[18]。ELISA操作步驟同1.3.3節(jié)。

1.3.5 雙抗夾心ELISA方法靈敏度和特異性的判斷

將37℃振蕩培養(yǎng)20h的LM 54007純培養(yǎng)液，平板計(jì)數(shù)后經(jīng)系列稀釋后作為待檢菌液加入雙抗夾心ELISA體系中，檢測(cè)該方法的靈敏度；用LM 54007和綿羊李斯特氏菌、E.coli O157:H7 44828、福氏志賀氏菌301、金黃色葡萄球菌 26003、阪崎腸桿菌 45401等實(shí)驗(yàn)室保存21株菌株的新鮮純培養(yǎng)液檢測(cè)雙抗夾心方法的特異性。檢測(cè)菌液的菌濃度均為1.0×108CFU/mL。

1.3.6 食品樣本檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)選取市售消毒牛奶、生菜、牛肉、果汁接種目的菌(LM 54007)和非目的菌(金黃色葡萄球菌26003、鼠傷寒沙門(mén)氏菌13311、福氏志賀氏菌301、E.coli O157: H7 44828和阪崎腸桿菌45401)。經(jīng)過(guò)前增菌后，作為檢測(cè)菌液加入本檢測(cè)系統(tǒng)，以檢測(cè)食品樣品對(duì)于本系統(tǒng)的敏感性和準(zhǔn)確性的影響。

目的菌的準(zhǔn)備：LM 54007用LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)20h后，用生理鹽水稀釋105倍。非目的菌的準(zhǔn)備：金黃色葡萄球菌26003、鼠傷寒沙門(mén)氏菌13311、福氏志賀氏菌301、E.coli O157:H7 44828和阪崎腸桿菌45401用LB培養(yǎng)，37℃振蕩培養(yǎng)8h后，用生理鹽水稀釋105倍。同時(shí)對(duì)這6株菌培養(yǎng)液進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。之后，目的菌和5株非目的菌各取1mL混合，標(biāo)記為A菌液。另外將5株非目的菌各取1mL混合，標(biāo)記為B菌液。

食品樣本的處理：將市售牛肉樣本研磨成肉糜，每份25g，共4份。稱取50g生菜，加入50mL PBS榨汁，每份25mL，共4份。對(duì)于消毒牛奶和果汁分別取4份，每份25mL。

每種食品樣本做4組實(shí)驗(yàn)，分別為BLEB增菌液添加A菌液組、BLEB增菌液添加B菌液組和LB增菌液添加A菌液組、LB增菌液添加A菌液組。首先取220mL增菌液、25g(25mL)樣品(樣品液)和5mL菌液，混勻后進(jìn)行增菌。BLEB增菌液實(shí)驗(yàn)組在30℃預(yù)增菌4h，之后向增菌液中加入配套選擇性試劑(吖啶黃、萘啶酮酸、放線菌酮)后30℃繼續(xù)培養(yǎng)[19]。LB增菌液實(shí)驗(yàn)組在37℃培養(yǎng)。分別在增菌16h和24h，取增菌液進(jìn)行雙抗夾心ELISA實(shí)驗(yàn)。同時(shí)各增菌液經(jīng)系列稀釋后涂布于OXA瓊脂平板(LM典型菌落在平板上呈現(xiàn)黑色并帶有黑色暈圈)，37℃培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果，以判定雙抗夾心ELISA方法的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 多克隆抗體效價(jià)

經(jīng)飽和辛酸-硫酸銨法純化的多克隆抗體，用間接ELISA方法測(cè)定其效價(jià)。由圖1可知多克隆抗體的效價(jià)約為3.2×105。

圖1 多克隆抗體效價(jià)曲線Fig.1 Titer cure of polyclonal antibody

2.2 多克隆抗體和單克隆抗體工作濃度的確定

表1 棋盤(pán)滴定法確定多克隆抗體和單克隆抗體稀釋倍數(shù)Table 1 Determination of poly- and mono-clonal antibody working concentration by chessboard titration

表2 雙抗夾心ELISA檢測(cè)靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Sensitivity of double-antibody sandwich ELISA

由表1可以看出，當(dāng)多克隆抗體抗體稀釋10000倍作為捕獲抗體時(shí)，單克隆抗體稀釋800倍和1600倍的OD450值均在1.0左右，稀釋800倍的P/N值較稀釋1600倍大，因此選擇多克隆抗體稀釋10000倍，單克隆抗體稀釋800倍為最終工作濃度。

2.3 雙抗夾心ELISA方法的靈敏度

經(jīng)過(guò)平板計(jì)數(shù)，新鮮LM 54007純培養(yǎng)液的菌濃度約為3.4×108CFU/mL。LM 54007純培養(yǎng)液經(jīng)梯度稀釋后作為檢測(cè)菌液測(cè)定本方法的靈敏度。如表2所示，本方法的檢測(cè)限約為1.7×105CFU/mL。

2.4 雙抗夾心ELISA方法的特異性

用LM 54007和實(shí)驗(yàn)保存的LM 54001等21株菌檢測(cè)雙抗夾心ELISA法的特異性。結(jié)果顯示，本方法與LM 54001有強(qiáng)烈的交叉反應(yīng)，說(shuō)明本方法可以檢測(cè)到不同血清型的LM。與綿羊李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌26003和阪崎腸桿菌45401有輕微的交叉反應(yīng)。其余的17株菌均無(wú)交叉反應(yīng)。

表3 雙抗夾心ELISA方法特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Specificity of double-antibody sandwich ELISA

2.5 食品樣本檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

表4 雙抗夾心ELISA方法特異性檢測(cè)食品樣本實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Detection of Listeria monocytogenes in food samples by double-antibody sandwich ELISA

通過(guò)平板計(jì)數(shù)，可推斷出最終接種于增菌液中的目的菌LM 54007的濃度約為10CFU/mL。用雙抗夾心ELISA方法檢測(cè)在不同增菌條件下的增菌液，通過(guò)測(cè)定OD值進(jìn)行判定。最終結(jié)果顯示添加有目的菌的BLEB增菌液和LB增菌液在增菌16h時(shí)就完全可以到達(dá)檢測(cè)限，檢測(cè)結(jié)果為強(qiáng)陽(yáng)性。沒(méi)有添加目的菌的BLEB增菌液，結(jié)果判定為陰性。4種食品樣本用無(wú)選擇性的LB增菌液增菌后的OD值均比選擇性BLEB增菌液的略高。BLEB增菌液組的ELISA結(jié)果與OXA平板計(jì)數(shù)結(jié)果均一致，而沒(méi)有添加目的菌的LB增菌液ELISA結(jié)果與平板計(jì)數(shù)結(jié)果對(duì)比后，存在假陽(yáng)性結(jié)果。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)以福爾馬林滅活的LM 54007免疫日本大耳兔，獲得了抗LM 54007的多克隆抗體。多克隆抗體經(jīng)辛酸-硫酸銨法純化后的效價(jià)可達(dá)3.2×105。以此多克隆抗體作為捕獲抗體，以實(shí)驗(yàn)室已制備的抗LM Internalin A單克隆抗體作為檢測(cè)抗體，建立了雙抗夾心ELISA方法。該方法對(duì)于LM 54007純培養(yǎng)液的檢測(cè)限約為1.7×105CFU/mL，可以和另一株不同血清型的LM有強(qiáng)烈的交叉反應(yīng)。

實(shí)際食品樣本中LM的存在量往往較少，無(wú)法達(dá)到檢測(cè)限的要求。因此，對(duì)檢測(cè)樣品來(lái)說(shuō)，進(jìn)行前增菌是必要的。本實(shí)驗(yàn)中采用FDA增菌方法，以具有選擇性的BLEB增菌液進(jìn)行前增菌。結(jié)果顯示，通過(guò)選擇性前增菌16h可以使樣品中的LM達(dá)到ELISA方法的檢測(cè)限。LB增菌液的OD值較高和假陽(yáng)性結(jié)果可能是由于能夠引起交叉反應(yīng)的金黃色葡萄球菌等菌可在沒(méi)有選擇性的LB增菌液充分生長(zhǎng)導(dǎo)致的。LM在選擇性增菌液中生長(zhǎng)良好，但選擇性試劑可抑制革蘭氏陰性菌和金黃色葡萄球菌等陽(yáng)性菌的生長(zhǎng)，從而能夠減弱與金黃色葡萄球菌等的交叉反應(yīng)，降低假陽(yáng)性率。本研究建立的方法用于實(shí)際樣本LM污染的篩查，可在48h內(nèi)報(bào)告結(jié)果(包括前增菌)，比國(guó)標(biāo)[20]等傳統(tǒng)檢測(cè)方法省時(shí)省力。本方法對(duì)設(shè)備要求較低，結(jié)果準(zhǔn)確性較高，具有一定的應(yīng)用前景。

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Detection of Listeria monocytogenes in Food by Sandwich ELISA

DUAN Xia1，HUANG Xin2，HUANG Ling-fang1，WEI Hua1，LAI Wei-hua1,*
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China；2. Nanchang Xihu District Center for Disease Control and Prevention, Nanchang 330025, China)

A rapid, specific and sensitive sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was developed to detect L. monocytogenes in food samples, which using polyclonal antibody as the capture antibody and anti-Internalin monoclonal antibody as the detection antibody. Anti-Listeria monocytogenes polyclonal antibody was prepared by using 0.5% formalin inactivated L. monocytogenes as antigen and Japanese rabbits as the host animal. The detection limit was 1.7×105CFU/mL in pure culture. Results showed that food samples had limited interference to the detection, while pre-enrichment using selective enrichment broth could significantly increase the detection limit and sensitivity.

Listeria monocytogenes；polyclonal antibody；monoclonal antibody；double-antibody sandwich ELISA

TS207.3

A

1002-6630(2010)24-0272-05

2010-08-07

科技部中小企業(yè)創(chuàng)新基金項(xiàng)目(10C26223601934)

段霞(1985—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：huaxiady666@126.com

*通信作者：賴衛(wèi)華(1968—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：talktolaiwh@163.com