高效液相色譜法測定刺玫果中金絲桃苷的含量

鐘方麗，王曉林*，敬采月

(吉林化工學院化學與制藥工程學院，吉林 吉林 132022)

高效液相色譜法測定刺玫果中金絲桃苷的含量

鐘方麗，王曉林*，敬采月

(吉林化工學院化學與制藥工程學院，吉林 吉林 132022)

目的：建立刺玫果中金絲桃苷含量測定的方法。方法：采用高效液相色譜法測定，色譜柱為Shim-pack VP-ODS C18(4.6mm×150mm，5μm)；以甲醇(A)和0.2%磷酸溶液(B)進行梯度洗脫，流速為1.0mL/min；進樣量20μL；檢測波長360nm；柱溫40℃。結果：金絲桃苷進樣質量濃度在4.76～76.16μg/mL范圍內呈良好的線性關系，r=0.9993。平均回收率為98.06%，RSD為1.72%。結論：采用高效液相色譜法測定刺玫果中金絲桃苷的含量，方法簡便、準確，可以用于刺玫果的質量控制。

刺玫果；金絲桃苷；高效液相色譜法

刺玫果系薔薇科薔薇屬植物山刺玫(Rosa davurica Pall.)的成熟果實，又名野薔薇果，是一種經濟價值極高、藥食同源的野生果類。廣泛分布于東北及內蒙、山西等省。《中藥大辭典》謂其有健脾理氣、養血調經的作用[1]。刺玫果含有大量的維生素、氨基酸、黃酮類和鞣質類化合物[2]，現代藥理學表明，黃酮類物質可加快血液流速，降低血液黏度，用于治療腦血栓、腦動脈硬化及冠心病等，其中黃酮類成分——金絲桃苷對心肌缺血、腦缺血損傷均有保護作用，還具有調節免疫作用[3]。

目前，以天然刺玫果為主要成分的保健藥物、保健食品、功能性飲料日益被人們所重視并廣泛開發[4]。尚未見有關刺玫果中金絲桃苷含量測定的研究，本實驗采用HPLC法測定刺玫果中金絲桃苷的含量，建立刺玫果中金絲桃苷的含量測定方法，為刺玫果的質量控制、綜合利用與開發提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

刺玫果由延吉市林業局提供，經吉林化工學院生藥學教研室鑒定為薔薇科薔薇屬植物山刺玫(Rosa davurica Pall.)的成熟果實。

金絲桃苷標準品(批號111521-200303) 中國藥品生物制品檢定所；甲醇(色譜純) 天津大茂化學試劑公司；水為重蒸餾水；其余所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

LC-20AB 型液相色譜儀、SPD-M20A 二極管陣列檢測器 日本島津儀器有限公司；Shim-pack VP-ODS C18色譜柱；BP211D 型電子天平 Sartorius公司；RT-08手提式高速中藥粉碎機 大德樂機械有限公司；JBT/CYCL型超聲波藥品處理機 濟寧金百特電子有限責任公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱為Shim-pack VP-ODS C18(4.6mm×150mm，5μm)；流動相：A為甲醇，B為0.2%磷酸溶液(V/V)，程序為0～20min，10% A；20～40min，40%～70% A；40～55min，70%～90% A；55～60min，90%～10% A[5-7]；流速：1.0mL/min；柱溫：40℃；進樣量：20μL；檢測波長為 360nm。

1.3.2 標準品溶液的制備

精密稱取金絲桃苷標準品適量，加甲醇配制成95.20μg/mL的溶液，作為標準品溶液[8-9]。

1.3.3 供試樣品溶液的制備

精密稱取2.50g刺玫果藥粉，加入20mL甲醇，超聲提取30min，過濾，收集提取液，濾渣加15mL甲醇，超聲提取20min，過濾，合并兩次提取液，過濾，轉移至50mL容量瓶中并用甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45μm)濾過，取續濾液，作為供試品溶液。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 檢測波長的選擇

文獻報道，采用高效液相色譜法測定金絲桃苷含量時，一般分別在350[6]、355[10]、360[11]、370nm[12]的檢測波長條件下測定，本實驗采用二極管陣列紫外檢測器對金絲桃苷的標準品溶液在波長200～500nm范圍內進行檢測，發現金絲桃苷在360nm波長處有特征吸收峰，金絲桃苷在360nm處靈敏度較高，峰形較好，根據實驗結果和參考文獻[8]確定360nm為檢測波長。

2.1.2 流動相條件的選擇

本實驗選擇的流動相為甲醇-0.2%磷酸溶液[6]，實驗中分別考察等度洗脫和梯度洗脫兩種方式，等度洗脫主要考察甲醇-0.2%磷酸溶液配比分別為35:65、40:60、50:50時金絲桃苷峰的出峰時間和峰型情況，結果配比為35:65時峰型較差，配比為50:50時出峰時間太短為3.287min，配比為40:60時出峰時間為6.8min，峰型較好，故選擇甲醇-0.2%磷酸溶液(40:60)為流動相，雖然采用等度洗脫的方式出現的色譜峰型良好，標準品出峰時間在6.8min左右，但由于刺玫果為天然植物，成分復雜，在這樣短的時間內可能會有一些物質沒有分開而堆積到一起，金絲桃苷峰與其他組分不能有效分離，這樣就不能保證實驗的真實性和可靠性，于是在等度洗脫的基礎上又進行梯度洗脫，而梯度洗脫金絲桃苷出峰時間約為26min左右，峰型良好，與其他組分能夠有效分離，故以甲醇(A)和0.2%磷酸水溶液(B)為流動相進行梯度洗脫，并且對流動相的配比進行探索，結果以甲醇(A)和0.2%磷酸水溶液(B)為流動相進行梯度洗脫，程序為0～20min，10% A；20～40min，40%～70% A；40～55min，70%～90% A；55～60min，90%～10% A，在此條件下樣品與標準品均分離較好，整個洗脫時間為65min，出峰時間約為26min左右，故選擇在上述流動相條件下進行研究。

2.1.3 分離柱的選擇

根據參考文獻[10]，選擇的色譜柱為Shim-pack VPODS C18(4.6mm×150mm，5μm)。

2.2 供試品溶液制備方法的選擇

采用70%乙醇加熱回流提取，甲醇超聲提取兩種方法處理樣品，結果發現，兩種方法所測出的金絲桃苷含量相差很少，但是甲醇超聲提取方法較70%乙醇加熱回流提取操作簡單、損失較少，故確定超聲提取方法作為供試品溶液處理方法。

2.2.1 提取次數的選擇

精密稱取5.0302g刺玫果粉末，分別提取1、2、3、4次，每次加入20mL甲醇，每次超聲提取30min，過濾，收集各次提取液，將各次提取液分別置于50mL容量瓶中，加甲醇定容，進行含量測定。由圖1可知，第1、2次提取液測得的金絲桃苷峰面積分別為3703.5、1942.4，經計算提取率達97.5%，結果表明超聲提取2次刺玫果中的金絲桃苷幾乎提取完全。

圖1 超聲提取次數對金絲桃苷提取效果的影響Fig.1 Effect of ultrasonic extracting times on extraction efficiency of hyperin

2.2.2 提取時間的選擇

在提取次數對提取效果的影響實驗的基礎上，進一步考察提取時間對提取效果的影響，精密稱取5.0280g刺玫果粉末，提取2次，每次加入20mL甲醇，第1次提取30min，第2次分別提取10、20、30、40min，將第2次的提取液分別置于50mL容量瓶中，加甲醇定容。用微孔過濾器(0.45μm)過濾，取濾液作為供試品溶液，進行含量測定。由圖2可知，超聲提取20min，金絲桃苷含量與30min和40min很接近，故超聲時間定為20min。

圖2 超聲提取時間對金絲桃苷提取效果的影響Fig.2 Effect of ultrasonic extracting time on extraction efficiency of hyperin

2.2.3 提取溶劑用量的選擇

在提取次數、提取時間對提取效果影響的基礎上，考察甲醇用量對提取效果的影響，精密稱取5.0178g刺玫果粉末，提取2次，第1次加入20mL甲醇，提取30min，第2次分別加入甲醇10、15、20、25mL，提取20min，將第2次的提取液分別置于50mL容量瓶中，加甲醇定容，用微孔過濾器(0.45μm)過濾，取續濾液作為供試品溶液，按2.1節色譜條件進行含量測定。

圖3 溶劑量對金絲桃苷提取效果的影響Fig.3 Effect of different volume of solvent on extraction efficiency of hyperin

由圖3可知，溶劑用量為15、20、25mL時測得的金絲桃苷的量相差不大，因此選用15mL提取。最終確定供試品溶液的制備方法[6,13]為超聲2次，第1次加入20mL甲醇，超聲30min，第2次加入15mL甲醇，超聲20min，合并提取液，過濾，轉移至50mL容量瓶中并用甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45μm)濾過，作為供試品溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性范圍考察

精密吸取金絲桃苷標準品溶液(95.20μg/mL)0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0mL，分別置10mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得質量濃度4.76、9.52、19.04、38.08、57.12、76.16μg/mL的梯度溶液。分別精密吸取20μL，進行測定，記錄峰面積，以金絲桃苷標準品進樣質量濃度C(μg/mL)為橫坐標，峰面積A為縱坐標，繪制標準曲線[14]。得回歸方程A=453.11C-331.80，r=0.9993，結果表明金絲桃苷進樣質量濃度在4.76～76.16μg/mL范圍內呈良好的線性關系。

2.3.2 精密度實驗

精密吸取質量濃度為19.04μg/mL的標準品溶液，連續進樣5次，測定金絲桃苷吸收峰面積，RSD為1.06%，結果說明精密度良好。實驗結果見表1。

表1 精密度實驗Table 1 Precision test of this method

2.3.3 穩定性實驗

取同一供試樣品溶液，分別于0、2、4、6、8h進行測定，記錄金絲桃苷吸收峰的峰面積，結果RSD為0.72%。結果表明樣品溶液在8h內穩定。實驗結果見表2。

表2 穩定性實驗Table 2 Stability test of this method

2.3.4 重復性實驗

取同一批刺玫果藥粉，按1.3.3節方法制備5份供試品溶液，依法測定金絲桃苷的含量，記錄金絲桃苷吸收峰的峰面積，結果RSD為1.60%。說明此方法重復性較好(表3)。

表3 重現性實驗數據Table 3 Reproducibility test of this method

2.3.5 加樣回收率實驗

取已知含量(139.51μg/g)的樣品5份，精密稱定，分別精密加入金絲桃苷標準品溶液3.6mL，按1.3.3節方法制備5份供試品溶液，按1.3.1節色譜條件測定，結果表明平均回收率為98.06%，RSD為1.72%實驗結果(表4)。

表4 回收率實驗結果Table 4 Results of recovery experiments

2.4 樣品測定

圖4 金絲桃苷標準品溶液色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of hyperin reference solution

圖5 供試品溶液色譜圖Fig.5 HPLC chromatogram of hyperin sample solution

分別取標準品溶液，供試品溶液各20μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結果見圖4、5。在此條件下供試品溶液中金絲桃苷的保留時間約為26min左右，分離度大于1.5，理論板數按金絲桃苷峰計算為7862，說明色譜條件適合本品的測定。

取3份刺玫果樣品，按1.3.3節方法制備供試品溶液，測得金絲桃苷的含量分別為133.91、139.51、141.01μg/g。

3 結 論

本實驗建立的含量測定方法操作合理簡便，方法精密度高，重復性及線性關系良好，回收率較好，可為含刺玫果的中藥制劑和功能性食品的含量測定提供依據。

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Determination of Hyperin in Rosa davurica Pall. by HPLC

ZHONG Fang-li，WANG Xiao-lin*，JING Cai-yue
(School of Chemistry and Pharmaceutical Engineering, Jilin Institute of Chemical Technology, Jilin 132022, China)

Objective: To establish a determination method for hyperin in Rosa davurica Pall.. Methods: A HPLC method was developed using Shim-pack VP-ODS C18(4.6 mm × 150 mm, 5 μm) column as the stationary phase and CH3OH-0.2% H3PO4as the mobile phase. The flow rate of mobile phase, injection volume of the sample and the column temperature were 1.0 mL/min, 20 μL and 40 ℃, respectively. The UV detection wavelength was 360 nm. Results: A good linear relationship between integral value of peak area and hyperin concentration in the range of 4.76-76.16 μg/mL (r = 0.9993) was observed. The average recovery rate of hyperin was 98.06% with the RSD of 1.72%. Conclusion: The HPLC determination of hyperin in Rosa davurica Pall. was characteristics of convenience and accuracy, which can be used for the quality control of Rosa davurica Pall..

Rosa davurica Pall.；hyperin；HPLC method

TQ244.2

A

1002-6630(2010)24-0281-04

2010-02-08

吉林省教育廳重點計劃項目(吉教科合字[2006]第122號)

鐘方麗(1970—)，女，教授，博士，主要從事天然產物化學成分及其生物活性的研究。E-mail：fanglizhong@sina.com

*通信作者：王曉林(1969—)，男，副教授，碩士，主要從事天然產物有效成分的提取及純化工藝研究。E-mail：wangxiaolin69@eyou.com