SPME-GC-MS分析近江牡蠣酶解液揮發性風味成分

劉曉麗，解萬翠，楊錫洪*，章超樺

(水產品深加工廣東普通高校重點實驗室，廣東海洋大學食品科技學院，廣東 湛江 524088)

SPME-GC-MS分析近江牡蠣酶解液揮發性風味成分

劉曉麗，解萬翠，楊錫洪*，章超樺

(水產品深加工廣東普通高校重點實驗室，廣東海洋大學食品科技學院，廣東 湛江 524088)

為得到風味良好的牡蠣酶解液，將新鮮的近江牡蠣肉經木瓜蛋白酶和中性蛋白酶水解，采用固相微萃取-氣相色譜-質譜(SPME-GC-MS)聯用法分析、鑒定牡蠣肉原料和酶解液的揮發性風味成分，探討酶解對牡蠣風味的影響。經NIST 98質譜數據庫檢索和文獻對照，3個樣品分別檢出57、60、62種成分，主要有烴類、醇類、醛類、酮類和含硫化合物等，它們的協同作用構成了牡蠣及其酶解液的特征氣味；其中牡蠣肉含有較多的酮類化合物，而酶解后則含有較多的醛類和脂類化合物，3個樣品中均檢出了較多的醇類化合物，歸一化含量分別高達40.24%、41.20%和43.28%，中性蛋白酶制備的酶解液比木瓜蛋白酶制備的酶解液風味更加柔和。結果表明：酶解反應能夠保持并改善牡蠣的風味，所制備的酶解液具有較好的應用前景。

近江牡蠣；酶解；固相微萃取；氣相色譜-質譜法；揮發性風味成分

牡蠣(Concha Ostreae)，俗稱海蠣子、蠔等，是著名的海產品，為世界第一大養殖貝類，世界瀕海各國幾乎都有盛產，在我國廣東、廣西、福建、浙江、臺灣等沿海地區都進行大量人工養殖。目前已發現牡蠣有100多種，中國沿海所產的牡蠣約有20多種[1-2]，而作為主要的養殖種類的近江牡蠣(Ostrea rivularis Gould)不僅肉質鮮美，而且營養豐富，除含有豐富的蛋白質(50.63%)、維生素和糖原(22.41%)等營養成分外，還富含多種維生素及銅、鐵、鋅、碘等微量元素及人體必需的10多種氨基酸，其中含碘量比牛奶和蛋黃高出200倍，尤其是含有豐富的牛磺酸、二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)等不飽和脂肪酸，具有很高的營養價值[3-5]。當前國內外除將牡蠣作為海味直接食用外，通過用蛋白酶對牡蠣進行酶解，研制出了營養口服液[6]、牡蠣酶解液營養粥[7]及蠔油調味料[8]等產品，將牡蠣肉經酶解、脫腥、調配等工藝，對其進行深加工利用，生產高檔天然的海鮮風味料, 具有很高的附加值[9]。而風味是影響食品可接受性的一個重要因素，因此本實驗擬采用先進的儀器手段，對牡蠣肉及其酶解液的揮發性香氣成分進行SPME-GC-MS分析和鑒定，探索風味組成與食品感官屬性的關系，旨在為牡蠣的深加工利用提供更多的基礎數據[10-14]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮近江牡蠣 湛江市購。

木瓜蛋白酶(食品級，800000U/g)、中性蛋白酶(食品級，200000U/g) 廣西南寧龐博生物工程有限公司；氫氧化鈉、鹽酸等均為分析純。

1.2 儀器與設備

Trace DSQ GC-MS氣相色譜-質譜聯用儀 美國Finnigan公司；SPME(含100μm PDMS萃取頭) 美國Supelco公司；HHS型電熱恒溫水浴鍋 上海博迅實業有限公司醫療設備廠；TDL-5-A低速臺式離心機 上海安亭儀器有限公司。

1.3 樣品制備方法

樣品1：取新鮮近江牡蠣肉，勻漿，待測；樣品2：取新鮮近江牡蠣肉，勻漿，用蒸餾水調料液比為1:3，以1mol/L氫氧化鈉和1mol/L鹽酸調pH6.0，添加木瓜蛋白酶進行恒溫酶解，蛋白中加酶量2000U/g，溫度50℃，反應時間4h，酶解后的酶解液在沸水浴下滅酶10min，冷卻后于4500r/min離心15min，取上清液保存待測；樣品3：取新鮮近江牡蠣肉，勻漿，用蒸餾水調料液比為1:3，以1mol/L氫氧化鈉和1mol/L鹽酸調pH 7.0，添加中性蛋白酶進行恒溫酶解，蛋白中加酶量2000U/g，溫度50℃，反應時間4h，酶解后的酶解液在沸水浴下滅酶10min，冷卻后于4500r/min離心15min，取上清液保存待測。

1.4 揮發性成分的捕集

采用固相微萃取法(SPME)吸附揮發性成分。SPME萃取條件：PDMS萃取頭(厚度100μm)；萃取溫度50℃；萃取時間30min。

將預處理過的3種樣品分別放入3支特制的15mL SPME旋蓋玻璃瓶中，迅速蓋上蓋子，在50℃水浴中預熱30min。從瓶蓋中插入萃取頭，吸附30min。待吸附完成后，進樣至氣相色譜進樣口解吸5min，然后經色譜-質譜聯用儀分析并鑒定揮發性風味成分。

1.5 揮發性成分的分析鑒定

采用氣相色譜-質譜聯用儀分離并鑒定揮發性成分，以質譜鑒定結果并結合文獻資料進一步分析牡蠣及其酶解液中揮發性化合物的組成及特點。

1.5.1 色譜條件

色譜柱：PEG 20M色譜柱(30m×0.25mm，0.25μm)；程序升溫：40℃保持2min，以每分鐘6℃的速度升至120℃，再以每分鐘10℃升至250℃，保持10min；載氣(He)流速0.8mL/min，壓力2.4kPa，進樣量0.5μL；不分流進樣。

1.5.2 質譜條件

電子轟擊(EI)離子源；電子能量70eV；傳輸線溫度250℃；離子源溫度200℃；質量掃描范圍m/z 33～450，檢測器電壓350V。

2 結果與分析

2.1SPME-GC-MS總離子流色譜圖

近江牡蠣原料和酶解后揮發性成分的GC-MS總離子圖如圖1所示，各組分質譜經計算機譜庫檢索及資料分析，分析并鑒定揮發性香氣成分，各檢出57、60、62種成分，將揮發性成分按照結構分類統計見表1。

圖1 3種樣品的揮發性成分總離子流色譜圖Fig.1 Total ion current (TIC) chromatogram of volatile compounds derived from three kinds of samples

2.2 牡蠣及其酶解液中揮發性成分的特點

經SPME-GC-MS檢測，由NIST 98質譜數據庫檢索和文獻對照，3個樣品中分別檢出57、60、62種成分，包括烴類、醇類、醛類、酮類、酯類、含硫化合物等，結果表明，近江牡蠣肉及其酶解液均含有豐富的揮發性風味化合物。

醇類在牡蠣肉及其酶解液中的含量是最大的，3個樣品分別檢出了19種，含量分別高達40.24%、41.20%和43.28%，可見，新鮮牡蠣肉中醇類化合物的含量本身就比較豐富，而經木瓜蛋白酶和中性蛋白酶水解后含量明顯增加，其中后者增加更明顯，例如2-辛烯-1-醇、環戊醇、叔丁醇、1-戊烯-3-醇、正辛醇、1-辛烯-3-醇、正己醇等醇類通常具有芳香、植物香，由于醇類化合物的高含量賦予牡蠣肉原生的柔和的甜瓜味，同時具有蘑菇味和脂味[15-16]。在揮發性醇類中，1-辛烯-3-醇在牡蠣原肉中的含量就高達17.43%，而在用木瓜蛋白酶和中性蛋白酶水解后，其含量仍然較高，分別達到了9.19%和12.04%，1-辛烯-3-醇為C8醇，是由一種亞油酸的氫過氧化物的降解產物，能貢獻出濃的、似植物的芳香[17]。

續表1

醛類在許多食品的氣味中起著關鍵的作用，3個樣品中分別檢出了17、18種和21種，其中從新鮮牡蠣肉中測出含歸一化量為30.69%，經木瓜蛋白酶水解后含量為29.65%，減少了1.04%，而經中性蛋白酶水解后含量增加到39.29%，說明用中性蛋白酶能夠產生較多的醛類化合物。酶解前后含量較多的醛類主要如反-2-辛烯醛類的短鏈不飽和醛，在三個樣品中分別為12.19%、8.67%和11.81%。此外，苯甲醛的含量在酶解前后有明顯的不同，如酶解之前為0.80%，而經木瓜蛋白酶和中性蛋白酶水解后，分別增加到3.73%和4.72%，可能是牡蠣肉中含有的大量的不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸在氧氣的作用下發生氧化降解而生成各種小分子化合物形成，它們產生清香、果香和堅果香的芳香特質的氣味[18]，使酶解液風味更加鮮美。其中己醛、庚醛和辛醛是多不飽和脂肪酸的代謝產物，具有生的或脆水果的氣味。

將3個樣品中的烴類化合物的歸一化含量相比，新鮮牡蠣肉中有10種，占8.91%，而經木瓜蛋白酶水解后，酶解液中的烴類化合物有9種，占6.51%，較前者明顯降低。但經中性蛋白酶水解后，其含量高達21.52%，其中主要是含有19.06%的7-甲基-3-亞甲基-1,6-辛二烯，而在其他樣品中并未檢出，這可能是在酶解加熱過程中經熱分解而得，其賦予酶解液具有令人愉快的、清淡的香脂氣味，但樣品3中也未檢出，還有待進一步分析。大量的烴類化合物，通常具有清香和甜香的風味，特別是具有支鏈的烷烴[19]，是由脂質衍生出來的，這些不飽和烴對海產品風味的產生可能起著很重要的作用，例如對二甲苯，在牡蠣原肉中并未檢測出，而牡蠣肉經中性蛋白酶水解后其含量為1.55%，這可能是類胡蘿卜素降解的產物，也可能是在酶解加熱過程中糖或者氨基酸的熱降解形成的[20]。

在新鮮牡蠣肉中酮類化合物的含量較其他樣品都高，為14.29%，而酶解后分別為3.25%、5.92%，明顯沒有新鮮肉中的高。例如1-辛烯-3-酮、3-辛酮、2,3-戊二酮等氣味均較強烈，它們的存在使得牡蠣肉具有不同的水果香、花香。在貝類中發現的甲基酮(C3～C17)，例如2-庚酮、2-戊酮可能是由其碳鏈的β氧化，再經脫羧作用形成的，這些化合物具有明顯的清香和水果香氣，而且隨著碳鏈的增長，有更顯著的花香味。

在3個樣品中都檢測到了揮發性含硫化合物如二甲基硫的存在，在3個樣品中的歸一化含量分別為5.67%、3.19%和3.77%，經酶解后含量明顯降低，多數含硫化合物的氣味特征是洋蔥味、卷心菜味、或煮沸的硫磺味和臭雞蛋味，因其閾值低而影響整個食物的香味。

在樣品2、3中還分別檢測到了1種和3種酯類化合物，樣品1中未檢測出，這可能是在酶解及加熱滅酶過程中形成的。

3 結 論

新鮮牡蠣肉中的揮發性風味成分很豐富，共檢出57種化合物，如烴類、酮類、醇類、醛類及含硫化合物等。酶解反應后得到的風味料則含有較多的醇類、醛類、酯類等化合物，提高了香氣品質，風味更加柔和，可作為調味品基料使用。

通過比較酶解反應前后的揮發性風味成分的變化，并將結果進行對照表明，新鮮貝類的風味以烴類和酮類化合物為主，而酶解產物則增加了醇類及部分酯類、醛類化合物，使得風味更加柔和。如環戊醇的含量由酶解前的1.5%，酶解后分別增加到4.61%和2.63%。同時，酮類化合物也相對減少，酯類化合物增加，從而使得酶解后的產品較酶解前風味更豐富，柔和。

結果表明，中性蛋白酶所制備的酶解液較木瓜蛋白酶酶解液的風味更好，如醇類、醛類、酯類等化合物的含量都較高，這可能與兩種酶的切割位點有關。

綜上所述，經蛋白酶水解后的酶解液所具有的獨特的風味，是烴類、醇類、醛類、酮類、酯類、含硫化合物等共同作用的結果。得到的產品是一種富有營養的天然海鮮調味料，并具有良好的安全性，可作為復合調味品的基料，具有較好的工業化應用前景。

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Analysis of Volatile Components in Ostrea rivularis Hydrolysates by SPME-GC-MS

LIU Xiao-li，XIE Wan-cui，YANG Xi-hong*，ZHANG Chao-hua
(Key Laboratory of Aquatic Product Advanced Processing of Guangdong Higher Education Institutes, College of Food Science and Technology, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088, China)

In order to obtain a good flavor oyster hydrolysate, fresh oyster (Crassostrea rivularis Crould) was hydrolyzed by papain and neutral protease. Volatile components in raw material and hydrolysates were analyzed by solid phase microextraction (SPME) and gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) to explore the effect of hydrolysis processing on flavor compounds. A total of 57, 60, and 62 kinds of volatile compounds in three samples were identified by comparing their mass spectra with NIST mass spectral database. Among these compounds, most of them were hydrocarbons, alcohols, aldehydes, kotones, and sulfuric compounds. The cooperation of these compounds provided a specific flavor of oyster and its hydrolysates. Kotones were the major components in raw material, whereas, aldehydes and esters were the major components in hydrolysates of oyster. Meanwhile, alcohols exhibited higher contents in three samples, and the contents of alcohols in three samples were 40.24%, 41.20% and 43.28%, respectively. Moreover, the hydrolysates obtained from neutral protease exhibited better flavor than the hydrolysates from papain digestion. Therefore, enzymatic hydrolysis reaction can improve the flavor of oyster and the prepared hydrolysates of oyster have promising application potential.

Ostrea rivularis Gould；enzymatic hydrolysis；solid phase micro-extraction (SPME)；gas chromatographymass spectrometry (GC-MS)；volatile flavor components

TS207.3

A

1002-6630(2010)24-0410-05

2010-09-24

農業部“948”項目(2006-G42)；國家現代農業產業技術體系建設專項(貝類，47)

劉曉麗(1984—)，女，碩士研究生，研究方向為食品加工與保藏。E-mail：lxl525j@163.com

*通信作者：楊錫洪(1963—)，男，副教授，博士，研究方向為食品化學與食品添加劑。E-mail：yangxihong63@163.com