薄膜分散法制備紫杉醇微乳及其質量評價

周麗娟，劉清飛，陳曦，王義明，羅國安（1.鄭州市中心醫院藥劑科，鄭州市450007；.清華大學生命科學與醫學研究院，北京市 100084）

紫杉醇（Paclitaxel，PTX）是一種萜類化合物，最早由Ghamande S等[1]從短葉紫杉的樹皮中分離并確定其化學結構，是近年來療效顯著的抗癌藥物之一。它能促進微管蛋白聚合、微管裝配，防止解聚，使微管穩定，并能抑制細胞分裂增殖，臨床可用于治療卵巢癌、乳腺癌、子宮癌、肺癌、食管癌、前列腺癌等[2]。由于紫杉醇水溶性極差（約0.001 g·L-1），口服幾乎不吸收，目前臨床應用的注射劑是以聚氧乙烯氫化蓖麻油-無水乙醇（50∶50，V/V）制成的無色黏稠液體，臨床使用時經氯化鈉注射液或5%葡萄糖注射液稀釋后靜脈滴注。但制劑中聚氧乙烯氫化蓖麻油極易引起過敏反應和低血壓，還可導致PVC包裝中增塑劑的溶出，使毒性增加，稀釋后宜析晶，從而限制了臨床的應用[3，4]。

微乳可增加難溶性藥物的溶解度，是難溶性藥物的理想載體。研究中筆者改變了傳統制備微乳的方法，采用制備膠束溶液或脂質體的薄膜分散法制備了紫杉醇O/W微乳（PTX ME），并對其處方、工藝及有關理化性質進行了研究。

1 材料

1.1 儀器

Agllent 1100型高效液相色譜儀，包括DAD檢測器（美國安捷倫公司）；TEM-philips Tecnai 20型透射電鏡（荷蘭飛利浦公司）；Zetasizer Nano ZS90型激光粒度散射儀（英國馬爾文公司）；BALZERS BAF-400D型冷凍蝕刻儀（列支敦士登公國Balzers公司）；XS105型電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；VDRTEX-5型旋渦混合器（江蘇海門其林貝爾儀器公司）；RE-5285A型旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；SPX-250型微電腦恒溫恒濕箱（上海特迅實業有限公司醫療設備廠）；SHH-100GD型強光照射試驗箱（重慶永生試驗儀器廠）。

1.2 試藥

PTX原料（浙江海正藥業股份有限公司，批號:20070601，純度:98.63%）；PTX ME（筆者自制，批號:071201、071202、071203，規格:10 mL∶30 mg）；炔諾酮對照品（NTD ，批號:100053-200204）、PTX對照品（批號:100382-200301）均由中國藥品生物制品檢定所提供；聚氧乙烯醚（ELP）、泊洛沙姆188（德國Basf公司）；卵磷脂（S-100）、中碳鏈甘油酯（MCT）、橄欖油（德國Lipoid公司）；注射用大豆油（江西金海棠藥用油公司）；維生素E（VE，廣州白云山制藥總廠）；脫氧膽酸鈉（美國Sigma公司）；無水檸檬酸（AR級，維坊英軒實業有限公司）；甲醇、乙腈（色譜純，德國Merck公司）；其余試劑均為分析純，水為注射用水。

2 方法與結果

2.1 處方制備

2.1.1 溶劑的選擇[5]分別取盛有約1 g的各種油（Oil）、表面活性劑（SA）、助表面活性劑（CoSA）的試管，分別逐漸加入PTX，渦旋12 h，置于60℃水浴中超聲振蕩8 h，室溫平衡24 h，若PTX溶解，則在溶劑中再逐漸加入PTX，直至達到飽和，比較PTX在各種溶劑中的相對溶解度，選擇制備PTX ME適宜的溶劑?？芍?，PTX 在 MCT（Oil）、ELP（SA）、無水乙醇（CoSA）中溶解度最大。PTX在不同溶劑中的相對溶解度見表1。

表1 PTX在不同溶劑中的相對溶解度（37℃）Tab 1 Relative solubility of paclitaxel in different solvents（37℃）

2.1.2 PTX ME的處方優選 按表1的定性測定結果，選擇MCT作為油相，ELP作為SA；處方中為了減少ELP的用量，同時加入S-100作為SA，無水乙醇為CoSA；為了防止處方中的S-100氧化，加入VE作為抗氧劑；加入DOC-Na有助于提高PTX的溶解度，也可作為輔助SA。各處方中將VE的量固定為0.5%，S-100的量固定為5%（處方規格:10 mL∶30 mg）。參考文獻[5，6]中繪制的偽三元相圖，選取在微乳區域的幾個處方，制備PTX ME，以制劑的外觀性狀、稀釋后放置的穩定性、粒徑作為評價指標，選出最優處方。PTX ME處方優化見表2（配伍后穩定性指加5%葡萄糖溶液稀釋10倍后溶液的穩定性）。

表2 PTX ME處方優化Tab 2 Prescription optimization of PTX ME

2.1.3 PTX ME的制備 稱取處方量的PTX、ELP、S-100、DOC-Na、MCT、VE，置于圓底燒瓶中，再加入處方量的無水乙醇，70℃水浴加熱使全部溶解，40℃水浴下旋轉蒸干，再于40℃真空干燥箱中干燥24 h，加入處方總量3%的無水乙醇和少量注射用水，磁力攪拌使其全溶，在磁力攪拌下緩緩滴加注射用水至全量的80%時，用適量的無水檸檬酸調節溶液pH值至5.0，加入注射用活性炭，吸附30 min，過濾脫炭，補加注射用水至全量，無菌條件下灌封于安瓿中，即得。結果表明，處方2、3配伍后穩定時間長，均能滿足臨床用藥要求，但處方3中ELP的用量相對較大，過敏反應強，故選擇2號為最優處方。

2.2 PTX ME的質量控制

2.2.1 外觀性狀 制備的PTX ME為澄明淡黃色液體。

2.2.2 pH值 按2005年版《中國藥典》（二部）附錄pH值測定法，測定其pH值為4.83。

2.2.3 形態學[7]研究 采用冷凍蝕刻技術[5]對PTX ME進行冷凍處理，于透射電鏡下觀察并照相，微乳乳滴呈圓球形，分布均勻。PTX ME冷凍蝕刻電鏡照片見圖1。

2.2.4 粒徑及分布考察[8，9]取PTX ME適量，加5%的葡萄糖注射液或0.9%的氯化鈉注射液分別稀釋10倍，用激光粒度散射儀測定微乳的粒徑及其分布。結果表明，PTX ME的平均粒徑分別為20.8 nm和20.7 nm，多分散指數為0.084和0.077，呈Gauss分布，約90%的粒子分布在11～32 nm。PTX ME經5%葡萄糖注射液稀釋后的粒徑分布見圖2。

2.2.5 載藥量和包封率的測定 （1）色譜條件:色譜柱為Agilent Tc-C18（250 mm×4.6 mm，5μm），流動相為甲醇-乙腈-水（35∶35∶30），流速為1.0 mL·min-1，檢測波長為227 nm，柱溫為30 ℃，進樣量為10 μL。方法學[10、11]表明，PTX空白微乳不干擾測定；PTX與NTD的分離度為4.98。線性方程為f＝0.058 3C＋0.011 7（r＝0.999 9，n＝6）。測定日內8 h和日間3 d的精密度，RSD分別為0.45%（n＝6）和0.64%（n＝6）；平均回收率為99.80%，RSD＝0.77%（n＝9）。可見，方法的精密度、回收率均較好。PTX的HPLC圖見圖3。

（2）包封率測定[12]:參照2005年版《中國藥典》微囊、微球與脂質體指導原則的要求進行本品的包封率測定。①洗脫曲線的考察:將葡聚糖凝膠G50用蒸餾水充分溶脹后裝柱（柱高∶內徑＝6∶1），洗脫液為蒸餾水。精密量取微乳（取PTX ME注射液，加5%葡萄糖注射液稀釋10倍）0.5 mL上柱，每1 mL收集1份樣品，然后按“2.2.5（1）”項下色譜條件測定。結果，微乳于6～13 mL之間流出，游離藥物于16 mL開始流出，微乳與游離藥物能完全分開。②柱層析方法的回收率考察:取微乳0.5 mL上柱后，13 mL前用蒸餾水洗脫，流出13 mL以后用20%乙醇溶液洗脫，收集25 mL內的洗脫液，加甲醇定容至25 mL。然后按“2.2.5（1）”項下色譜條件測定洗脫后的藥物總量（W），并測定原上樣0.5 mL微乳中含有的藥物總量（W0），按下式計算:柱回收率（%）＝W/W0×100%。分別按上法上樣0.4、0.5、0.6 mL，結果，柱回收率分別為99.31%、98.89%、97.11%（n＝3），表明該方法具有較高的回收率。③包封率的測定:按“2.2.5（2）①”項下方法，收集微乳部分的洗脫液，加甲醇定容至25 mL，按“2.2.5（1）”項下色譜條件，測定收集的流出液中的藥物總量W；取同批樣品測定0.5 mL微乳中含有的藥物總量W0；包封率（%）＝W/W0×100%。載藥量和包封率的測定結果見表3。

表3 載藥量和包封率的測定結果（±s，n＝3）Tab 3 Drug-loading rate and encapsulated efficiency of PTX ME（±s，n＝3）

表3 載藥量和包封率的測定結果（±s，n＝3）Tab 3 Drug-loading rate and encapsulated efficiency of PTX ME（±s，n＝3）

批號71201 71202 71203包封率/%97.03±2.54 97.89±1.68 96.24±2.74載藥量/g·L-1 3.032±0.004 2.985±0.003 3.015±0.004

2.2.6 穩定性試驗 （1）配伍試驗:PTX ME在臨床使用時，須用5%葡萄糖注射液或0.9%氯化鈉注射液稀釋后靜脈滴注，因此筆者進行配伍試驗觀察其穩定性。結果，配伍后12 h內一直呈略帶乳光的澄清透明溶液，含量、pH值、平均粒徑均無明顯變化，表明該制劑在12 h內穩定。（2）影響因素考察:①光照試驗:取PTX ME注射液（批號:071201），置于60℃恒溫箱中，4 ℃、光照（4 000～5 000 Lx）放置10 d，分別于0、5、10 d末取樣測定。②凍融試驗:將樣品置于－4℃2 d，再放置于40℃2 d，即凍融1次，連續循環3次，考察外觀、pH值、載藥量、粒徑、有關物質[13]。微乳除了在60℃和40℃試驗條件下有關物質略有增加外，其他條件各項指標均無明顯變化，表明PTX ME受溫度影響較大，高溫貯藏不穩定，應低溫放置。PTX ME的穩定性試驗結果見表4。

表4 PTX ME的穩定性試驗結果（n＝3）Tab 4 Stability of PTX ME（n＝3）

3 討論

研究中選取的輔料均可供注射用；且選取的最優處方中ELP的用量只有3%，相對于市售的PTX注射液（用量為50%）減少了94%，極大降低了過敏反應的發生率。

處方中加入的S-100有利于PTX和形成微乳乳滴的穩定性。DOC-Na的加入增加了膜的穩定性和PTX的溶解性，阻止了PTX的析出，而且毒副作用小，廣泛用于乳劑型注射劑制備的使用中[14]。筆者將常用的制備脂質體和膠束的薄膜分散法和微乳制備方法相結合應用于制備微乳，突破了微乳傳統的制備方法，擴展了新技術的應用范圍，這將為其它藥物微乳的制備提供參考。

色譜條件優選中，經預試驗發現，采用甲醇-乙腈-水（20∶30∶50）[13]的流動相，PTX的出峰時間太慢，保留時間約30 min。通過調節流動相的比例，最終確定流動相為甲醇-乙腈-水（35∶35∶30），PTX和NTD的出峰時間可控制在10 min內，且能達到很好的分離，能節省分析時間，提高分析效率。

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