香蕉原生質體的電融合研究

劉代，魏岳榮，胡家金

（1.湖南農業大學生物科學技術學院，湖南 長沙 410128;2.廣東省農業科學院果樹研究所，廣東 廣州 510640）

到目前為止，只有3篇關于通過體細胞雜交成功獲得香蕉雜種植株的報道[1-3]。本研究以在我國廣泛種植的香蕉栽培品種“過山香”（Musa AAB Silk cv.Guoshanxiang）和具有抗病、抗寒基因的野生阿寬蕉（Musa itinerans Cheesm.AB Group）為材料，探索香蕉電融合的技術參數，旨在通過體細胞雜交為香蕉栽培品種轉入抗病、抗寒基因，從而達到改善香蕉品質的目的，為香蕉的體細胞雜交和品種改良提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料香蕉品種“過山香”和野生阿寬蕉。

1.1.2 培養基與酶液（1）懸浮培養基為M2培養基:MS鹽+100 mg/L麥芽提取物+100 mg/L谷氨酰胺＋100 mg/L肌醇+1 mg/L生物素＋1 mg/L 2,4-D+45 g/L蔗糖，pH 5.3。（2）看護培養基:MS鹽+Morel and Wetmore維生素＋2 mg/L 2，4-D+250 mg/L葡萄糖＋72 g/L麥芽糖＋20 g/L蔗糖＋2 mL/L椰乳，pH 5.7，過濾滅菌。（3）野生阿寬蕉原生質體的分離酶液:3.0%纖維素酶（Cellulase，Onozuka R-10，Yakult）+0.2%果膠酶（pectinase，Yakult）+1%離析酶（Macerozyme，R-10，Yakult）。（4）分離“過山香”原生質體的酶液:3.5%纖維素酶（Cellulase，Onozuka R-10，Yakult）+0.15%果膠酶（pectinase，Yakult）+1%離析酶（Macerozyme，R-10，Yakult）+15.2 g/L KCl+7.8 g/L CaCl2+11%甘露醇+100 mg/L MES。

1.2 試驗方法

1.2.1 野生阿寬蕉原生質體的分離野生阿寬蕉ECS參考魏岳榮方法通過種子途徑建立，初始接種量為1.5%，每隔15 d繼代1次，培養溫度27℃，懸浮暗培養，搖床轉速110 r/min。

取懸浮培養繼代后7 d的ECS經200μm的細胞篩過濾后，取0.5 mL PCV的ECS加入到10 mL酶液中進行酶解。酶采用酶溶解液（15.2 g/L KCl、7.8 g/L CaCl2、11%甘露醇、100 mg/L MES）進行溶解，pH 5.7，經直徑0.22μm微孔濾膜過濾滅菌。在50 r/min的搖床上，27℃，黑暗條件下酶解8 h。采用過濾離心法進行原生質體的洗滌和純化，純化后的原生質體，最后用電融合液洗滌2次，電融合液的組成為:11%甘露醇+0.1 mmol/L CaCl2，然后將原生質體用電融合液調整密度為105個/mL備用。

1.2.2 “過山香”原生質體的分離“過山香”香蕉的胚性細胞懸浮系（ECS）由廣東省農業科學院果樹研究所通過多芽體途徑建立[4]，參照肖望等的方法[5]分離“過山香”原生質體。純化后的原生質體用電融合液洗滌2次，最后將原生質體用電融合液將密度調至105個/mL備用。

1.2.3 原生質體的融合將處理后的親本原生質體按1∶1體積混合，取250μL原生質體混合液體小心地加入到電融合儀融合小室的底部，電融合儀為“Multiporator 4308（Eppendorf公司）”，融合室為250μL螺旋型鉑金電極，電極間距為0.2 mm。將鉑金電極小心地插入融合室中，緩慢旋緊使融合室不產生氣泡，然后連接到共軸連接頭上，靜置10 min，選擇設計融合參數，室溫下進行電融合實驗。

1.2.4 電融合參數的選擇利用電融合儀平行單電極微型融合池（電極間距0.2 mm）進行“過山香”和野生阿寬蕉原生質體電融合參數的選擇。將50 μL原生質體混合液均勻地加入到微型融合池中，在倒置顯微鏡下靜置10 min后，觀察原生質體成串情況，改變電極間的交流電場和電擊時間使得大多數細胞成串為2～3個，施加直流脈沖電壓，優化融合參數，使融合率和原生質體活力達到最佳值。在倒置顯微鏡下統計融合率，用熒光素雙醋酸酯（FDA）染色法進行原生質體活力檢測。每個數據為5個視野的平均數，重復3次。融合率按以下公式計算:

1.2.5 融合產物的培養融合完畢后，靜置20 min，將原生質體懸浮液從融合室內用移液體槍小心吸出置于1.5 mL離心管中，在800 r/min轉速下離心5 min后去掉上清液，再添加1 mL原生質體培養基，在800 r/min轉速下離心5 min，去掉上清液。最后用原生質體培養基調整原生質體密度為5×105個/mL。參考肖望等的方法[10]取其1 mL加入到看護培養基中，27℃，暗培養。

2 結果與分析

2.1 交流電場強度對原生質體串珠形成的影響

交流電壓（AC）的強度以及作用時間直接影響到原生質體融合時的成串效果。將雙親原生質體按1∶1的比例混合后加入融合室中后，靜置10 min，待大多數細胞沉降下來，使融合細胞處于同一層次，從而避免原生質體處于空間不同位置而不能成串。施加交變電壓，細胞的成串效果是由AC強度及其作用時間共同決定的，AC強度過小、作用時間過短，使細胞不能緊密相鄰，難以達到融合；AC強度過大和時間過長，一方面對細胞造成傷害，另一方面易形成多細胞融臺體。表1結果顯示:在電極距為0.2 mm的條件下，當AC增加到100 V時，原生質體開始有轉動現象，但細胞很少有成串排列現象；當AC增加至150 V時，原生質體開始移動，并且沿電場方向形成平行排列的串珠；當AC增加至200 V時，串珠長度大約為2～3個/串；AC強度繼續增加，則形成串珠的時間縮短，且串珠長度增加，原生質體開始有變形現象；此時繼續加大AC強度，一部分原生質體被拉得很長而破裂。由此可見，調整AC強度和時間對提高香蕉原生質體理想細胞串有明顯效果。試驗表明，AC作用強度200 V/cm、作用時間30 s為香蕉原生質體融合的適宜交流電場強度。

表1 交流電場對原生質體串珠形成的影響

2.2 直流脈沖強度對原生質體融合的影響

直流脈沖（DC）強度是影響原生質體融合效率的一個重要因素。當大多數細胞成為2～3個串珠時，施加瞬時DC脈沖電壓，細胞開始融合，施加的脈沖電壓以細胞串振動和串珠剛剛斷裂為標準，靜置約20 min后融合體成為圓球體。表2結果顯示直流脈沖強度對融合效率的影響，當DC強度為500 V/cm時，未能觀察到原生質體融合；隨著DC強度的增加，原生質體融合率逐漸升高，但細胞活力下降；當DC強度為1500 V/cm時，融合率達到最高，為32.4%；隨著DC強度的繼續加大，原生質體融合頻率下降，部分串珠解體和部分原生質體破裂，還有部分原生質體失活，從而影響以后的培養效果。因此，確定DC強度1500 V/cm為香蕉原生質體融合的適宜脈沖強度。

表2 不同直流脈沖強度對融合率的影響

2.3 直流脈沖作用時間對原生質體融合的影響

在AC為200 V/cm，AC作用時間30 s，DC強度為1500 V/cm的條件下，研究了不同DC作用時間對原生質體融合率的影響，試驗結果見表3。當DC作用時間為10μs時，沒有融合的發生；當DC作用時間為40μs時，融合率達到32.7%，活力80.5%；當DC作用時間為50μs時，融合率達到最高，為34.9%，但此時原生質體活力下降到76.1%；DC作用時間為60μs時，融合率和原生質體的活力均下降。據此，確定最佳DC作用時間為50μs。

表3 不同直流脈沖作用時間對融合頻率的影響

2.4 直流脈沖作用次數對原生質體融合的影響

在AC為200 V/cm，AC作用時間30 s，DC強度為1500 V/cm，DC作用時間為40μs的條件下，研究了不同DC作用次數對原生質體融合率的影響。從試驗結果（表4）看出:脈沖次數對原生質體融合率和細胞活力具有一定的影響，當脈沖次數為1次時，融合率較低；脈沖次數為2次時，原生質體融合率和原生質體活力達到最大，分別為32.4%和81.4%；脈沖次數超過3次時，部分原生質體開始破裂，原生質體活力下降。因此，確定脈沖次數2次為理想脈沖次數。

表4 脈沖次數對原生質體融合率的影響

3 討論與結論

細胞融合技術在植物育種上具有很大的意義，它既能克服種間雜交的不親和性，又能在親緣關系較遠的植物之間轉移染色體及細胞質，從而創造出新物種。電融合是通過適當強度的電脈沖處理使原生質體質膜發生可逆擊穿而融合。它與PEG介導融合法相比，具有對細胞傷害小、易于觀察等特點。雖然電融合原理已經清楚，但在實際操作中理想參數的確定受材料、融合儀及融合室類型的影響。如交變場強過大或脈沖強度過強均會造成原生質體破損，但若交變場強強度過小或脈沖強度不夠，則融合效果不佳。在香蕉原生質體電融合過程中觀測到不同層次上的原生質體在同一交流電場上的作用下的運動速度不同，成串時間也不同，并且不同層次上的原生質體由于空間位置關系不容易粘連。本試驗將原生質體混合液靜置10 min后，使原生質體全處于同一層次上再進行電融合參數的選擇，從而確立最佳的電融合參數。本試驗建立適合香蕉原生質體體細胞雜交的電融合參數體系是:在電融合液為11%甘露醇+0.1 mmol/L CaCl2的條件下，AC強度為200 V/cm，作用時間30 s時，原生質體兩兩緊密接觸，成對效果好；對直流脈沖的研究發現，DC強度為1500 V/cm，作用時間40μs，脈沖次數2次時，原生質體融合的效率和活力達到最高值，分別為32.4%和81.4%。這一結果為香蕉體細胞雜交及再生培養研究提供了技術參考。

[1]Matsumoto K,Vilarinhos A D,Oka S.Somatic hybridization by electrofusion Of banana protoplasts[J].Euphytica,2002,125（3）:317-32.

[2]Assani A,Chabane D,Haicour R,et al.Protoplast fusion in banan（Musa spp.）:comparison of chemical（PEG:Polyethylene glycol）and electricalprocedure[J].Plant Cell Tiss.Org.Cult,2005,83（2）:145-151.

[3]Xiao Wang,Huang Xia,Gong Qing,et al.Somatic hybrids obtained by asymmetric protoplast fusion between Musa Silk cv.Guoshanxiang(AAB)and Musa acuminate cv.Mas（AA）[J].Plant Cell,Tissue and Organ Culture,2009,97（3）:313-321.

[4]魏岳榮，黃學林，黃霞，等.香蕉多芽體的誘導及其體細胞胚發生[J].園藝學報，2005，32:414-419.

[5]肖望，黃霞，魏岳榮.“過山香”香蕉原生質體培養及植株再生[J].園藝學報，2008，35（6）:873-878.