水稻微小RNA研究進展

彭建斐，戴良英，何玉科，許永漢

（1.湖南農業大學生物安全科學技術學院，湖南 長沙 410128；2.上海植物生命科學研究院，上海植物生理生態研究所，上海 200032；3.浙江省植物代謝基因工程重點實驗室，浙江省農業科學院，病毒學與生物技術研究所，浙江 杭州 310021）

微小RNA（miRNA）是一種廣泛存在于真核生物中的21 nt左右的非編碼小分子RNA，絕大多數是真核生物基因表達的一類負調控因子。它主要在轉錄后水平上通過介導mRNA靶分子的切割或降低靶分子的翻譯來調節植物基因的表達，從而調控植物器官的形態建成、生長發育、激素分泌與信號轉導以及植物對外界環境脅迫因素的應答能力。盡管植物微小RNA（miRNA）研究起步較晚，但由于鑒定方法的不斷發展，植物miRNA的報道數量呈幾何級數增長。水稻作為單子葉模式植物和主要的糧食作物，其微小RNA（miRNA）研究也取得了長足的進步。

1 水稻miRNA的生物合成

1.1 miRNA生物合成步驟

植物miRNA基因由RNA聚合酶II轉錄成為初級的轉錄本（pri-miRNA），pri-miRNA具有一段并不完全互補的雙鏈RNA區域，和一個大的發夾結構[1]。接著，Pri-miRNA在RNA聚合酶III（Dicerlikel，DCLl）的作用下，被剪切成雙鏈的miRNA/miRNA*前體（pre-miRNA）[2-3]。這一對雙鏈的RNA分別被稱之為指導鏈和伴隨鏈，與miRNA*的5′端相比，miRNA的5′端配對更不穩定，可能正是這種特點導致了miRNA最終進入RISC復合體，miRNA*被排除在RISC外而降解[4]。

1.2 miRNA生物合成相關蛋白

Dicer-like1（DCL1）是miRNA生物合成所最必需的蛋白，DCL1將具有發夾結構的pri-miRNA剪切加工成雙鏈的pre-miRNA。Dicer酶具有一個位于氨基酸末端的DExH-box RNA解旋酶結構域，一個在ARGONAUTE（AGO）也具有的PAZ結構域，兩個RNaseⅢ結構域和一個碳端的dsRNA結合結構域[5]。水稻中具有 6個 DCL1蛋白 OsDCL1、OsDCL2a、OsDCL2b、OsDCL3a、OsDCL3b 和 OsDCL4[6]。曹曉風等[7-8]通過RNA干擾技術（RNAi）獲得了OsDCL1和OsDCL4功能缺失的水稻轉化體，深入研究顯示，miRNA含量在dcl1轉化體中顯著下降，而在dcl4轉化體中卻沒有明顯變化，表明OsDCL1對于miRNA的發生具有重要的作用。

ARGONAUTE（AGO）是一種miRNA的效應復合體，能與成熟的miRNA結合形成RNA誘導的沉默復合體（RISC）來調控靶基因的表達。AGO蛋白質主要包含兩個結構域：PAZ和PIWI結構域，但具體功能現在尚不清楚。最近的研究表明，PAZ結構域結合到siRNA的3′的二核苷酸突出端；一些AGO蛋白質的PIWI結構域賦予slicer以內切酶的活性。同時，不同的AGO蛋白質有著不同的生物學功能。北京生命科學研究院的戚益軍研究組[9]同樣利用RNAi技術同時沉默了水稻的4個AGO1基因，研究顯示，水稻轉化體出現了復雜的發育表性，還發現AGO1蛋白具有切割mRNA的活性，并且它們都對U起始的小分子RNA具有偏好性。作者進一步克隆了與AGO1結合的小分子RNAs并進行高通量測序，發現AGO1s主要結合已知的miRNAs，表明這些AGO1對調節水稻的生長發育有著重要的作用。

在植物miRNA合成途徑中，還有其他非常重要的蛋白起著非常重要的作用，HYL1（HYPONASTIC LEVEAL 1）和 SE（SERRATE）被認為能夠幫助DCL1精確快速地剪切雙鏈RNA產生pre-miRNA[10]。HEN1具有甲基轉移酶的結構域，可在體外甲基化miRNA/miRNA*雙鏈，而miRNA的3′末端甲基化可以穩定miRNA.大多數甲基化的miRNA/miRNA*在轉運蛋白HST（HASTY）的幫助下從細胞核轉移到細胞質中[11]。然而在水稻中這些蛋白的功能尚未清楚。

2 水稻miRNA的功能研究

2.1 miRNA參與水稻發育調控

Chris A Helliwell等[12]研究小組研究發現，在水稻中過表達miR172能夠延緩水稻開花時間，從而導致水稻花器官和種子發育異常，結實率低和種子重量下降。深入研究發現miR172抑制了AP-2家族中SUPERNUMERARY BRACT（SNB）和其他靶基因的表達。在擬南芥中，miR172的功能已經得到了很好的詮釋，miR172控制了開花時間和花器官的分化。

2.2 miRNA參與逆境脅迫

林鴻宣等[13]研究小組發現miR169家族的成員都會受到高鹽脅迫的誘導，在干旱和高鹽的處理下，檢測到受處理水稻體內miR169表達普遍上調。深入研究顯示miRNA169受dehydration-responsive element（DRE）的誘導。與此同時，miR169n還受到了ABA的上游調控，影響了NF-YA基因表達[14]，從而參與水稻抗旱功能表達。

2.3 miRNA參與激素傳導

吳平等[15]在探索OsSPX基因在耐磷饑餓機制過程中發現，OsSPX3能夠調控miR399的表達，同時發現OsIPS1能與miR399相互協作調控了Os－PHO2，從而在水稻耐低磷中起著重要的作用。此外，該實驗組對水稻抗生長素的突變體osaxr的芯片數據進行分析，發現一些miRNA降低了植株的生長素敏感性。深入研究發現，這些miRNA的啟動子中存在生長素響應因子（AuxREs），Yang 等[16]發現水稻miR167的表達受生長素的誘導上調，并在轉錄后指導對水稻ARF8的mRNA剪切。miRNA對水稻不定根的發育也有著重要的調節作用，miR164也在水稻中有著組織上的特異表達[17-18]。一些miRNA可在受脫落酸（ABA）、赤霉素（GA）、茉莉酸（JA）、水楊酸（SA）和其他植物激素誘導的組織中檢測到，如 miR159、miR160、miR164 和 miR167。

2.4 miRNA參與抗病毒感染

病毒感染是一個廣泛影響植物生長發育的生物因素，每年因植物病毒感染而導致大多數農作物和果樹減產30%左右。在長期的進化過程中，植物已經形成了一些抵制病毒感染的機制，其中一種機制就是病毒介導的轉錄后基因沉默。已有越來越多的證據表明miRNA與病毒介導的疾病以及病毒誘導的基因沉默有關。現已從植物病毒中鑒定出的RNA沉默抑制因子有30多種，如p19、p21、p25和p69等，這些抑制因子通常稱為致病因子。致病因子通常可阻礙siRNA的形成，或影響siRNA的穩定性，或干擾siRNA與RISC復合物的結合，并能導致植物的一些相關疾病的產生和引起發育畸型。

3 水稻miRNA的鑒定和實驗驗證

3.1 水稻miRNA的鑒定

加州大學基因組生物學研究中心與植物科學系的朱健康教授等[19-20]從水稻的根、莖、花組織中，構建出了3個miRNA的cDNA文庫。他們已經鑒定出35個miRNA分子，其中有14個miRNA分子是首次被發現的，并且證明了13個全新的miRNA家族。在這14個首次發現的miRNA分子中，有13個在擬南芥基因組中找不到保守區域。其中4個與親緣關系較近的單子葉植物有相關的保守性。推測這4個miRNA分子是單、雙子葉植物分化后進化形成的。剩余的9個新發現的miRNA在其他植物的已知序列中尋找不到相似序列。在被檢的水稻組織中，miRNA分子得到廣泛的表達，盡管有許多miRNA顯示為組織特異性表達。朱教授對水稻中全新miRNA的鑒定，說明這些小RNA分子可能在水稻中獨立演化，而在其他植物中漸漸消沉。

另外，通過非生物的逆境脅迫，研究人員發現了很多原本表達豐度不高的miRNA，曹曉風等[21]通過構建水稻低溫、干旱、高鹽、ABA和對照的5種cDNA文庫，通過克隆18～26 nt的小RNA并測序，檢測到了7種與水稻抗逆相關的新miRNA。同樣，在對水稻進行重金屬鎘脅迫的時候也發現了19種新的miRNA，表明許多miRNA在水稻的生長發育和逆境脅迫應答中起著重要的作用[22]。

特拉華大學的科學家與美國國內外的同事合作，發現了一種新型分子，它可以關閉水稻的基因[23]。他們發現的新型分子稱為自然反義微RNA（natmiRNAs），由長度大約20個核苷的短小的核糖核酸組成，它們的靶標是位于水稻細胞DNA反向鏈上它們直接面對的基因。由于天然的堿基互補能夠被Dicer類的RNA酶切割，從而降解靶基因的表達水平。

3.2 水稻miRNA的靶基因預測

目前，大多數實驗室將計算機分析與實驗方法結合使用，使得miRNA的數量呈幾何級數增長。但是尋找已知的miRNA基因的靶位點的工作進展并不理想，現在大多數實驗室是利用生物信息學手段預測miRNA所作用的靶基因的功能，而缺乏可靠的實驗依據。因而尋找并分離出靶基因也是一項比較艱巨而重大的工作。

4 miRNA的技術應用

盡管植物miRNA調控發育過程的復雜性和多樣性還沒有完全被解析，但已經有報道成功利用miRNAs進行基因工程和基因功能研究的操作。利用人工miRNAs（artificial miRNAs）可以進行組織特異性的、可誘導性的、部分基因失活或幾個序列相關基因同時激活的轉基因介導基因沉默。例如構建一個同時具有3個不同靶基因（Pds，Spl11和d Eui1/CYP714D1）的人工miRNA載體轉入水稻，會發現其靶基因的表達水平都降低了，并且轉化體出現了預期的表型，能夠穩定遺傳[24]。因此人工miRNAs提供了一種新的敲除基因的手段，大大方便了對目的基因進行功能研究。

5 討論

在短短的8 a時間內，植物miRNA的研究取得了突飛猛進的成果，它為植物生物學的研究提出了新的研究思路。水稻作為一種單子葉模式植物和重要的糧食產物，其miRNA成為了當今分子生物學研究的熱點領域。越來越多的植物生長發育的機理被揭示出來，同樣，也出現了越來越多新的問題擺在我們面前。如miRNA對多個靶基因的網絡調控具體機制是怎樣的，miRNA作用過程中是否有放大效應，水稻中究竟有多少miRNA，如何查清楚水稻中的miRNA并找出它們的靶基因和揭示它們的功能。只有揭示其作用的靶基因后才能更好地進行功能研究，從而也才可以弄清楚它在生命活動中的作用。雖然目前的研究已經揭示出了大量的miRNA，但是其下游的靶基因以及功能的研究并沒有太多的進展。水稻miRNA和小RNA的研究還有很長的路要走。

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