木霉的分離和對辣椒白絹病致病菌的抑制效果研究

馮俊清，李媛媛，楊揚，洪亞輝

(湖南農業大學生物科學技術學院，湖南 長沙 410128)

辣椒白絹病是一種嚴重的土傳性病害，由病原菌Sclerotium rolfsii Sacc.引起[1－2]。辣椒植株受害初期莖基部呈暗褐色，其上長出白色絹絲狀菌絲體，呈輻射狀向四周擴展，后期病部菌絲和地表菌絲體都可產生褐色白菜籽狀菌核，不久后植株萎蔫落葉死亡[3]。這種病害防治難度大，固而有“南方疫病”之稱。目前關于辣椒白絹病生物防治的研究較少。因此，尋找生防菌資源,探索控制辣椒白絹病的生物防治途徑，對農業可持續發展具有重大意義[4－6]。木霉菌廣泛存在于土壤中，對多種植物病原真菌具有拮抗作用，是一類研究得較多的生防資源，能通過競爭作用、重寄生作用、抗生作用、誘導抗性等多方面機制影響土傳病原菌的正常生長和代謝[7]。

本實驗擬從染病植株中分離辣椒白絹病致病菌、從病害嚴重區土壤中分離木霉菌，并研究木霉對辣椒白絹病的生物防治效果和機制。

1 材料與方法

1.1 材料

染病辣椒植株采集自醴陵市賀家橋鎮辣椒白絹病重病區田中，土樣亦從此處采集。

培養基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基,馬鈴薯汁200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉18 g。

1.2 方法

1.2.1 白絹病致病菌的分離、純化將染病的辣椒植株去掉葉片和部分枝條后置于潮濕陰暗處，用濕毛巾蓋在植株根部。24 h后根部長出白色絲狀真菌。在超凈工作臺上用已消毒的鑷子夾取少許菌絲，將真菌絲在鏈霉素溶液中消毒后接種于PDA培養基中，倒置在28℃的培養箱中培養。白色菌絲長滿約1/2培養皿時，用接種環挑取菌絲，接種到另一個PDA培養基中。重復篩選4次，所得純化的真菌即白絹病致病菌，做好標記，并保存。

1.2.2 白絹病致病菌菌核的培養將純化的白絹病致病菌接種于PDA培養基平板中，倒置在28℃的培養箱中培養15 d后即得深褐色菌核。

1.2.3 木霉菌的分離、純化將采集到的土樣粉碎，分裝于50 mL的燒杯中，每燒杯裝20 g樣土，灑水少許，使其濕潤。將白絹病菌菌核用鑷子夾到小燒杯樣土中，每燒杯15粒。燒杯用黑色塑料膜封口，置于陰暗處。20 d后將菌核從土壤中挑出,接種到PDA培養基上，于28℃的培養箱中進行培養。約3 d后在菌核周圍有木霉長出。木霉長到1/2個培養皿大小時，用接種環挑取菌絲接種到PDA培養基上。重復純化4～5次，將純化的木霉標記并保存。

1.2.4 對峙實驗在超凈工作臺上將白絹病致病菌用滅菌后的接種環接種到PDA培養基平板的一側，同時用將木霉接種到PDA培養基的另一側,于28℃的恒溫培養箱中倒置培養，并觀察記錄抑制效果，用十字交叉法測量病原菌菌落半徑，以只接種致病菌的平板作對照。于平板培養第7天分別計算13株木酶對辣椒白絹病致病菌的抑菌率，計算方法見公式（1）。

抑菌率（%）＝[（對照菌落半徑-與木霉對峙培養的菌落半徑）/對照菌落半徑]×100[8]（1）1.2.5外界環境條件對木霉生長的影響由對峙實驗結果比較分析，選出一株對辣椒白絹病致病菌有較強抑制效果的木酶菌，研究外界環境條件（溫度、培養基pH值、外界光照時間）對其生長狀況的影響。（1）溫度對木霉生長影響。將4個恒溫箱的溫度分別設定為30、40、50、60℃，再將已接種的PDA平板上置于其中，進行倒置培養，觀測木霉生長狀況。（2）環境pH值對木霉生長影響。配制不同pH值的PDA培養基，于木霉接種后置于28℃的恒溫培養箱中進行倒置培養，觀測其生長狀況。（3）光照強度木霉生長狀況影響。將待試木霉菌種放置于室外接受陽光直射，光照處理3、6、9 h后，分別接種于平板上進行倒置培養，觀測其生長狀況。

2 結果與分析

2.1 白絹病致病菌的分離

如圖1所示，在PDA平板培養基上成功得到純化的辣椒白絹病致病菌。病菌菌絲發達，白色，有絹絲狀光澤，在基物上呈羽毛放射狀向四周生長；菌絲有隔，生長速度快；菌絲細長，適應能偏酸性環境。

2.2 白絹病致病菌菌核培養

如圖2所示，致病菌在PDA培養基上培養10 d后，菌絲上開始凝結，形成很多細小顆粒狀菌核，初為白色或淡黃色，后變為褐色至黑褐色，呈球形或不規則形，直徑為0.5～3.0 mm。表面平滑有光澤，結構致密，干燥時外殼極堅硬。

圖1 在28℃恒溫箱中培養5天后的白絹病致病菌

圖2 在28℃恒溫箱中培養15天后的白絹病致病菌菌核

2.3 木霉的分離、純化

從采集到的土樣中共分離得到13株木霉菌。木霉生長速度快，培養初期菌絲白色、半透明，培養5～6 d開始形成孢子，孢子呈淡綠色、淡黃色或綠色。

2.4 對峙實驗

由表1可以看出，分離出的木霉菌在實驗條件下對辣椒白絹病的生長均有不同程度的抑制作用，其中7號和13號木霉的抑制效果最好，抑菌率分別達到73.2%和74.1%。

表1 1-13號木霉與致病菌對峙實驗抑菌圈半徑

2.5 外界環境條件對木霉生長的影響

2.5.1 溫度對木霉生長影響在不同溫度下培養72h，每天定時測量菌落直徑，所得木霉生長數據見表2。表2數據表明，木霉在30～40℃之間生長速度較快，生長狀況較好；在50℃左右雖然生長速度較慢，但仍然有菌絲體生長；60℃以上則無生長。這說明木霉菌具有一定的耐熱性，但是溫度過高會殺死菌種，使之不能生長。

2.5.2 環境pH值對木霉生長影響如表3所示，木霉在環境條件pH值5.0、6.0、7.0時生長狀況良好，其中6.0時生長速度最快，在pH值變為8.0時，生長速度緩慢。由此可見木霉的最適pH為弱酸性，在弱酸性環境中會迅速生長，堿性環境會抑制木霉的生長。

表2 不同溫度下條件下木霉生長狀況

表3 不同pH值對木霉生長的影響

2.5.3 光照時間對木霉生長的影響如表4所示，光照對木霉有一定的影響，光照3 h與光照6 h對木霉的影響基本無差異，但當光照時間達到9 h后，木霉的生長受到了抑制。

表4 不同光照時間對木霉生長的影響

3 小結與討論

本實驗共分離純化得到13株木霉菌，從對峙實驗結果可以看出，分離到的木霉對白絹病致病菌均有不同程度的生長抑制作用，為進一步研究木霉對白絹病的抑制機理打下基礎。

實驗結果表明，木霉是一種較能耐熱、耐酸性菌，當環境溫度達到50℃時也能生長。在中性或偏酸性環境下，木霉生長速度極快，在偏堿性的條件下生長則會受到抑制。光照強度也是影響木霉生長的一個重要因素，實驗證明，強日光照射6 h不會對木霉生長產生影響，光照9 h以上時會對木霉起抑制作用。這些實驗數據能夠充分證明木霉是一種優良的拮抗微生物，在生物防治領域具有重要的研究價值[10-11]。它能夠在環境比較惡劣的情況下生長，能產生多種酶系抑制病原微生物的生長。木霉生長迅速，利于同病原菌競爭生存空間和營養物質，也可以達到抑菌的作用。

本實驗只是初步探討了外界環境對木霉生長狀況的影響和木霉對辣椒白絹病致病菌的抑制效果，今后需要更深入地研究其作用機制和生物學特性，以期尋找到更多、更高效、更適合于工業化生產的菌株，為木霉生產提供更可靠的科學依據。

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