RP-HPLC法測定貓豆中貓豆胍的含量Δ

黃增瓊，蔣偉哲，黃敏，黃興振，巫世紅（.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，南寧市 53002；2.右江民族醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，百色市 533000）

貓豆又名貓爪豆、狗爪豆、龍爪豆，是豆科藜豆屬植物龍爪藜豆 Stizotobium cochinchinensis（Lour）.Tang et Wang的種子[1]，廣西是最主要的產(chǎn)區(qū)。貓豆中主要成分為左旋多巴，是國內(nèi)提取左旋多巴最主要的原料藥材[2]。筆者已經(jīng)從貓豆中提取分離得到一種生物堿類化合物——貓豆胍，其具有一定的鎮(zhèn)靜催眠作用[3]。有關(guān)貓豆中貓豆胍的含量測定方法目前未見有報道，為了今后更好地對貓豆胍藥物制劑進行質(zhì)量控制，本研究建立了以反相高效液相色譜（RP-HPLC）法測定貓豆中貓豆胍含量的方法。研究結(jié)果表明，所建立的方法準確、簡便、專屬性強、重復(fù)性好，可作為貓豆藥材或含貓豆胍的藥物制劑的含量測定方法。

1 材料

1.1 儀器

LC-9000D型HPLC儀（南寧市威瑪龍色譜科技有限公司）；ME215S型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；AS5150A型超聲波處理器（天津奧特比賽恩斯有限公司）。

1.2 試藥

貓豆胍標準品（純度：99.54%，廣西醫(yī)科大學(xué)新藥研究開發(fā)中心制備）；貓豆藥材（廣西邦爾植物制品有限公司，批號：070309，經(jīng)右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院劉春榮副主任中藥師鑒定為真品）；甲醇為色譜純，其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：PhenomenexTMC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.1 mol·L-1冰醋酸-甲醇（95∶5）；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：324 nm；柱溫：室溫；進樣量：20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 標準品溶液的制備：取貓豆胍標準品約10 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，加0.1 mol·L-1冰醋酸溶解至刻度，配制成濃度為0.1180 mg·mL-1的標準品貯備液。精密量取該貯備液10 mL，置25 mL量瓶中，加0.1 mol·L-1冰醋酸至刻度，制成濃度為0.0472 mg·mL-1的標準品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備：取貓豆粗粉約1 g，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加0.1 mol·L-1鹽酸至刻度，浸泡24 h，不時振搖，抽濾，記錄濾液體積，即得供試品溶液。

2.2.3 陰性對照溶液的制備：以0.1 mol·L-1鹽酸溶液和0.1mol·L-1冰醋酸溶液作為陰性對照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

取標準品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液，按“2.1”項下色譜條件分別注入HPLC儀測定，記錄色譜圖（見圖1）。貓豆胍保留時間約為7.2 min，主峰與相鄰雜質(zhì)峰的分離度＞1.5。理論塔板數(shù)按貓豆胍峰計算應(yīng)應(yīng)不低于10000。在該色譜條件下，陰性對照溶液對樣品測定無干擾。

圖1 高效液相色譜圖A.標準品；B.供試品；C.鹽酸陰性對照；D.冰醋酸陰性對照Fig 1 HPLC chromatogramsA.reference substance；B.sample；C.negative control of hydrochloric acid；D.negative control of glacial acetic acid

2.4 線性關(guān)系考察

精密量取“2.2.1”項下標準品貯備液0.5、1、2、4、8 mL，分別置于10 mL量瓶中，加0.1 mol·L-1冰醋酸至刻度，搖勻，制成濃度分別為0.0059、0.0118、0.0236、0.0472、0.0944 mg·mL-1的系列溶液，按“2.1”項下色譜條件分別進樣測定。以對照品質(zhì)量濃度（X，mg·mL-1）為橫坐標，峰面積積分值（Y）為縱坐標，制備標準曲線，得回歸方程為Y＝2000000X－3547.4（r＝0.9999）。結(jié)果表明，貓豆胍的質(zhì)量濃度在0.00590～0.0944 mg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗

取“2.2.1”項下標準品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次。結(jié)果，RSD＝0.67%（n＝6），表明儀器精密度較高。

2.6 穩(wěn)定性試驗

按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液1份，室溫放置，按“2.1”項下色譜條件分別于0、3、6、9、12 h進樣測定。結(jié)果，RSD＝1.24%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗

取同一批樣品6份，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定。結(jié)果，平均含量為0.356%，RSD＝3.18%（n＝6），表明本法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗[4]

取已知含量的同批供試品溶液9份，分別加入對照品溶液適量，進樣測定，計算回收率和RSD，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝9）Tab 1 Results of recovery test（n＝9）

2.9 樣品含量測定

取貓豆樣品6份，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定。另取“2.2.1”項下標準品溶液進樣測定。按外標法計算供試品中貓豆胍的含量。結(jié)果，貓豆中貓豆胍的平均含量為0.341%，RSD＝1.76%。

3 討論

經(jīng)紫外掃描，貓豆胍在324 nm波長有最大吸收，在246 nm波長處有次大吸收。在246 nm波長下，貓豆中的貓豆胍、左旋多巴以及其它成分都有吸收，對試驗有一定干擾；而采用324 nm波長進行測定，其它成分在該波長條件下無吸收，對試驗無干擾，專屬性更高，故確定測定波長為324 nm。

試驗中對流動相條件進行了探索。參考文獻[5]以0.1 mol·L-1冰醋酸-甲醇（9∶1）作為流動相，出峰時間過早，樣品峰未能與溶劑峰分離。筆者將流動相比例調(diào)整為0.1 mol·L-1冰醋酸-甲醇（95∶5）進行試驗，貓豆胍的保留時間在7 min左右，分離度和峰形均較好。

[1]江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1977：1423.

[2]蔣偉哲，周燕文，吳 闖，等.不同產(chǎn)地貓豆中左旋多巴的含量比較[J].中草藥，2000，31（11）：861.

[3]廣西醫(yī)科大學(xué).一種生物堿類化合物及其制備方法和用途[P].中國專利：200810073635.9.2008-06-20.

[4]陳念祖，王東蕾，黃滔敏.RP-HPLC法測定薄荷腦樟腦滴鼻液中樟腦的含量[J].中國藥房，2009，20（6）：453.

[5]黃海濱，許學(xué)健，奉建芳.高效液相色譜法測定貓豆中左旋多巴的含量[J].廣西植物，1994，14（3）：293.