腹膜間皮細胞的培養(yǎng)及TGF-β1 CTGF蛋白含量測定

徐慶，陸頌華（南通市第三人民醫(yī)院肛腸科，江蘇南通226006）

腹膜間皮細胞的培養(yǎng)及TGF-β1 CTGF蛋白含量測定

徐慶，陸頌華
（南通市第三人民醫(yī)院肛腸科，江蘇南通226006）

目的建立簡便有效的腹膜間皮細胞體外培養(yǎng)鑒定及TGF-β1、CTGF蛋白含量測定方法。方法胰蛋白酶-EDTANa2消化網(wǎng)膜組織培養(yǎng)腹膜間皮細胞；用形態(tài)學、免疫組化鑒定細胞。結(jié)果分離培養(yǎng)的細胞符合間皮細胞特征；ELISA法測定細胞培養(yǎng)液中TGF-β1、CTGF蛋白含量簡便可行。結(jié)論胰蛋白酶消化法是一種簡單實用的分離腹膜間皮細胞的方法；ELISA法測定細胞培養(yǎng)液中TGF-β1、CTGF蛋白含量，可能成為衡量預防術后腹腔粘連藥物療效的客觀指標。

間皮細胞；TGF-β1；CTGF；蛋白；含量測定

近年來有關腹腔粘連的發(fā)生機理多傾向于炎癥學說［1］。認為各種因素造成腹膜損傷，導致炎癥滲出，產(chǎn)生纖維蛋白粘連。事實上，任何機械損傷、腹膜炎癥、組織缺血等病理因素均可引起腹膜的損傷，使腹膜的纖維蛋白溶解酶活性降低，導致大量的纖維蛋白沉積于腹腔器官及腹膜壁層表面而形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，最終形成永久的纖維結(jié)締組織性粘連。纖維蛋白沉積和降解之間是否平衡是形成粘連的決定性因素［2］。正常的腹膜間皮細胞具有纖溶活性，有多種生長因子和細胞因子參與調(diào)控纖維蛋白沉積和降解之間的平衡，其中轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）β1、結(jié)締組織生長因子（CTGF）與粘連的形成關系密切。因此，建立腹膜間皮細胞體外培養(yǎng)體系及TGF-β1、CTGF蛋白含量測定方法，為研究腹膜間皮細胞生理功能及其在腹腔粘連防治中的作用提供了有效手段。現(xiàn)階段國內(nèi)對腹膜間皮細胞TGF-β1、CTGF蛋白含量的測定，基本屬于空白。筆者綜合文獻方法并加以改進，建立了簡便有效的腹膜間皮細胞體外培養(yǎng)及TGF-β1、CTGF蛋白含量方法。

1 實驗材料

1.1 材料無菌取自南通市第三人民醫(yī)院普外科腹部手術切除的大網(wǎng)膜。

1.2 儀器設備眼科剪、鑷，培養(yǎng)皿，50 mL培養(yǎng)瓶，吸管，10 mL尖底離心管，CO2培養(yǎng)箱，超凈臺，離心機，倒置相差顯微鏡，100目不銹鋼篩，0.22μm濾膜過濾器，方盤，Labsystems Finnpipette 100μL單道移液器，Thermo 50μL 8道移液器，HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司），Thermo Multiskan Spectrum spectrophotometer酶標儀，伯樂BD-108冰箱（－30℃）。

1.3 試劑

1.3.1 PBS液氯化鈉8.0 g，氯化鉀0.2 g，磷酸氫二鈉1.56 g，磷酸二氫鉀0.2 g溶于1 000 mL三蒸水中，過濾滅菌分裝，室溫保存。

1.3.2 1640培養(yǎng)基（Invitrogen Corporation公司產(chǎn)品）按說明配制，并使其含有青鏈霉素各100 U／mL，小

牛血清20%，過濾除菌分裝，－20℃保存。

1.3.3 細胞消化液胰蛋白酶（國藥集團化學試劑有限公司）2.5 g，EDTA二鈉鹽（國藥集團化學試劑有限公司）0.16 g溶于1 000mL PBS液中，過濾除菌，分裝于小瓶內(nèi)，－20℃保存。

1.3.4 免疫組化抗體波形蛋白抗體，第8因子抗體，CD45抗體，ElivisionTMplus廣譜試劑盒均為（均為福建邁新公司產(chǎn)品）。

1.3.5 Elisa測定試劑盒goat anti rat Connective Tissue Growth Factor Elisa測定試劑盒，goat anti rat Fibronectin Elisa測定試劑盒goatanti rat Transforming Growth Factor typeβ1 Elisa測定試劑盒（美國ADL公司）。

1.3.6 TNF-α抗體（南京生興）。

2 實驗方法

2.1 腹膜間皮細胞的培養(yǎng)將剪取的網(wǎng)膜組織（約3 cm×3 cm）置于含青、鏈霉素的無菌生理鹽水中浸泡漂洗后，平鋪于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，PBS反復漂洗，剪除血管及脂肪，將漂洗后的網(wǎng)膜組織剪碎，加入胰蛋白酶－EDTA細胞消化液20 mL，放置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)消化25min，每5 min振搖1次，最后5 min保持靜止。將消化液用100目不銹鋼篩過濾于培養(yǎng)皿內(nèi)，加入等量完全培養(yǎng)液終止消化。分裝于10 mL尖底離心管，1 000 r／min，離心10min，棄上清，加入適量完全培養(yǎng)液溶解細胞沉淀，分裝于50 mL培養(yǎng)瓶，放置于培養(yǎng)箱內(nèi)。原代細胞培養(yǎng)24 h后，以等體積的新鮮完全培養(yǎng)液替換瓶內(nèi)全部陳舊培養(yǎng)液，此后每3 d換液1次。約培養(yǎng)（4～7）d細胞生長融合，可以首次傳代。當細胞生長融合成單層，PBS漂洗2次，每瓶加入完全消化液2 mL，在培養(yǎng)箱內(nèi)消化15 min。鏡下觀察細胞消化情況，細胞脫落變形后，加入4 mL完全培養(yǎng)液終止消化。將細胞懸液分裝于離心管內(nèi)1 000 r／min，離心10 min，棄上清，加入適量完全培養(yǎng)液溶解細胞沉淀，分別傳代于50mL培養(yǎng)瓶和含蓋玻片的6孔板內(nèi)，加入適量完全培養(yǎng)液，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)至細胞完全貼壁伸展。

2.2 腹膜間皮細胞的鑒定免疫組化鑒定：細胞爬片入10%中性福爾馬林固定；入0.1%Triton×100；滴加即用型一抗，室溫下孵育60 min BPS洗3次。每張蓋玻片分別滴加50μL ElivisionTMplus廣譜試劑盒中的試劑A及試劑B；顯色，復染；脫水；封片。

2.3 ELISA法測定細胞培養(yǎng)液中TGF-β1、CTGF蛋白含量采用ELISA法測定細胞上清液中TGF-β1、CTGF蛋白含量。（試劑盒購自福建邁新公司）：直接取細胞上清50μL進行測定。（1）測定前將試劑盒放置室溫30 min，使用前將所有試劑都輕輕搖勻；（2）濃縮洗滌液與新鮮的醫(yī)用雙蒸水1∶20倍稀釋，混勻待用；（3）取出酶標板，加入50μL的細胞上清于空白微孔中，先后加入10μL的生物素標記液及50μL的酶標記溶液；（4）用保鮮膜密封酶標板，然后置于37℃的水浴鍋中準確水浴60min；（5）在每個孔中分別加入底物A 50μL底物B 50μL，用移液器反復吸打，進行混勻；（6）輕微振搖酶標板，然后在37℃水浴鍋中避光反應15 min；（7）每個微孔中加入50μL的終止液，用移液器反復吸打，進行混勻；（8）在Thermo Multiskan Spectrum spectrophotometer酶標儀上，450 nm處測定OD。

3 結(jié)果

光鏡下剛從腹膜消化下來的間皮細胞呈分散的小圓型細胞，約24 h左右貼壁，個別細胞伸展。72 h所有貼壁細胞均伸展，呈梭形等，邊緣不整，細胞呈現(xiàn)拉網(wǎng)狀生長，與相鄰的細胞相互連接。以后細胞拉網(wǎng)生長現(xiàn)象減少，生長融合呈多角形，大小較為一致，似鋪路石樣外觀。免疫組化鑒定，光鏡下觀察所培養(yǎng)細胞的波形蛋白染色為陽性。ELISA法測定細胞培養(yǎng)液中TGF-β1、CTGF蛋白含量簡便可行。

4 討論

間皮細胞作為一種特殊的上皮細胞，由于其生長環(huán)境的特殊性，是上皮細胞中最難培養(yǎng)的細胞之一。目前國內(nèi)外培養(yǎng)間皮細胞的方法大致有以下幾種：（1）腹水、透析液中分離培養(yǎng)間皮細胞。（2）以網(wǎng)膜組織或腹膜組織為來源進行的組織塊培養(yǎng)法。（3）以各種組織細胞消化酶如膠原酶、胰酶、EDTA或胰酶＋EDTA進行的消化法培養(yǎng)。（4）用動物的網(wǎng)膜或腹膜進行培養(yǎng)。本實驗所建立的腹膜間皮細胞培養(yǎng)模型，方便、易行、廉價、高效、重復性高，為體外研究腹膜間皮細胞生理功能及其在腹腔粘連防治中的作用提供了有效手段。TGF-β1、CTGF等具有調(diào)節(jié)纖溶酶原激活物的活性作用從而抑制術后腹腔粘連的發(fā)生，ELISA法測定細胞培養(yǎng)液中TGF-β1、CTGF蛋白含量，可能成為衡量預防術后腹腔粘連藥物療效的客觀指標。

R392.12

B

1007－4813（2010）05－0753－02

徐慶（1975－），男，碩士研究生。研究方向：肛腸科疾病。