重金屬富集模式動物粉正蚓Lumbricus rubellus的研究

李 維，吳文如，林小樺，喻良文，李 薇

(廣州中醫藥大學，廣東廣州 510006)

·方藥研究·

重金屬富集模式動物粉正蚓Lumbricus rubellus的研究

李 維，吳文如，林小樺，喻良文，李 薇＊

(廣州中醫藥大學，廣東廣州 510006)

粉正蚓Lumbricus rubellus作為一種富集重金屬離子的模式動物，是近年來國內外學者研究重金屬富集機制及調控原理的重點關注對象。對粉正蚓重金屬富集相關的國內外研究現狀進行了系統地梳理和分析，同時還總結了重金屬富集研究的方法，并提出了今后研究的發展方向，以期為重金屬富集相關的研究提供可以借鑒的思路和方法。

粉正蚓;重金屬富集;金屬硫蛋白;重金屬響應元件;應用

粉正蚓Lumbricus rubellus為環節動物門寡毛綱(Oligochaeta)動物，原產于包括英國等國在內的歐洲大陸，后經殖民活動傳播至美洲，現整個太平洋地區均有廣泛分布[1]。粉正蚓不僅因其藥食皆用而與民眾生活息息相關，同時也因其常生活于礦質土中，通過不斷地縱橫鉆洞，掘穴松土、破碎、分解有機物和吞土排糞等生活習性，能高效地吸食和分解有機物質、改良土壤，而成為土壤生物學和生態學的動物研究模型[2]。特別是近年粉正蚓體內能耐受蓄積高濃度的重金屬離子的現象被發現后，粉正蚓又成為國外學者關注的熱點:一方面以粉正蚓為代表研究動物體內重金屬富集的機制;另一方面利用其進行重金屬污染土壤的修復和改造。

筆者所在研究組在研究中藥地龍重金屬含量超標時也發現地龍某些來源的原動物，如參環毛蚓Pheretima aspergillum，具有與粉正蚓相似的重金屬富集特性，該結果將另文報道。考慮到參環毛蚓與粉正蚓的分類學上的親緣關系以及相似的生物學特性，本文著重對粉正蚓重金屬富集相關的國內外研究概況進行了系統地梳理和分析為本組進一步研究地龍的重金屬富集機制尋求可供借鑒的思路和方法，同時也對其他類似研究工作提供參考依據。

1 粉正蚓重金屬富集特性的發現和確定

粉正蚓成蟲長約60～140 mm，背赤紅有光澤而腹白，因此，國外有人稱其為“紅色蠕蟲”(Red Wriggler)。由于這種蚯蚓既可食用、也具備一定的臨床藥用價值，所以在與人類相關的食物鏈中扮演著重要的角色。然而，研究者們偶然發現了粉正蚓能夠生存在重金屬污染較嚴重的地區，并且能夠蓄積其進食土壤中的重金屬元素，尤其是對鎘(Cd2+)和銅(Cu2+)具有較高的耐受能力，其Cd2+含量甚至可以達到干體重的1/1 000[3]，遠高于其他類別的蚯蚓。粉正蚓的重金屬富集特性的發現，使其更加成為學者們的研究熱點。特別是在當今關注環境的熱潮里，人們又把粉正蚓作為環境中重金屬污染程度的生態監測指標(Biomarker)[4]，并研究如何將粉正蚓用于改善生態土壤環境，使其成為清除土壤重金屬的工具[5]。

隨著研究不斷地深入，人們發現粉正蚓不僅能夠被動地耐受鎘、銅、鉛、汞、鋅、鍶等各類金屬離子，而且還對某些重金屬離子存在著主動富集的特性[6]。Stürzenbaum SR[7]考察了英國 Rudry 地區 (礦區)粉正蚓與當地泥土中重金屬濃度的相關性，該地區土壤中分別含鉛(Pb)2337μg/g、鋅(Zn)5902μg/g、鎘(Cd)604μg/g(干重) ，粉正蚓體內含鉛 (Pb)892μg/g，鋅(Zn)2 470μg/g，鎘(Cd)1 213μg/g(干重)。結果表明，鋅、鉛在粉正蚓體內含量相應地均比同重量泥土中的含量要低，而鎘在粉正蚓體內含量則比土壤中含量高出一倍。由此可見，與鋅、鉛相比，粉正蚓對重金屬鎘存在著高濃度主動蓄積的現象。

隨后，研究人員又對重金屬離子鎘在粉正蚓體內的分布規律進行了研究，并發現，鎘離子對重金屬的吸收主要集中在粉正蚓腸部上皮以及腸道皺褶，而黃色細胞囊組織則是重金屬鎘的最主要分布組織;在鈣腺及其囊泡中也發現有鎘的分布，但因分布較少，認為可能不是鎘離子的主要排泄途徑，同時腎管部分也涉及到鎘離子的排泄，并且是一個會引發病理損害的主要靶點，而鎘離子在外部的表皮及縱肌組織中的分布則微乎其微[8]。

對于不同的金屬離子，來源于受不同程度重金屬污染土壤的粉正蚓種群存在著適應性的差異。英國學者Edward F[9]采用了系統的非穩態動力學實驗對粉正蚓的重金屬富集特性進行考察，非穩態動力學的研究包括了吸收實驗(蚯蚓從未受污染的地區轉移至受污染地區)和消除實驗(蚯蚓從受污染地區轉移至未受污染地區)，實驗中把排泄時間作為一個重要變量，檢測不同時間里蚯蚓體內的重金屬濃度。吸收實驗發現，粉正蚓對鎘，銅，鉛，鎳和鋅的富集都在一定程度上依賴于土壤中的金屬濃度;而富集效率在含低濃度的重金屬土壤中更大。而消除實驗則發現，粉正蚓在對重金屬排泄過程中保留了對鎘的蓄積，其體內含量隨著排泄時間的增加反而不斷提高。目前對粉正蚓的非穩態動力學研究非常廣泛，改良方法也多樣。例如，Mari～no F[10]為了考察粉正蚓對不同棲息環境的適應性，將分別來源于含鈣和含鍶豐富土壤的同類蚯蚓引進至不受重金屬污染的土壤中飼養，經消除實驗后再交叉轉移至對方的棲息土壤中交叉飼養，結果發現，源于含鍶地區的蚯蚓能夠富集更多的鈣。而又有學者在其基礎上設計對粉正蚓種群及其后代對重金屬吸收程度的遺傳特性研究[11]，或者研究不同地區種群的粉正蚓對各類金屬離子的生物積累過程[12]。總之，各種實驗均證實:粉正蚓對鎘等重金屬有害元素具有顯著的耐受和富集作用。

2 粉正蚓重金屬富集機制的探索

粉正蚓能夠在體內富集不同類型的重金屬離子，這一現象引發了人們對其重金屬富集機制的探索與研究。Stürzenbaum SR等[3]通過凝膠色譜技術對粉正蚓體內具有與鎘緊密結合的蛋白質進行提取分離，然后進行氨基酸末端序列分析，研究表明，粉正蚓種系中具有金屬響應特性的蛋白具備其他種系動物金屬硫蛋白的共同特征，是生物體金屬硫蛋白(Metallothioneins，MT)家族的一員。Morgan AJ等[13]通過收集重金屬污染嚴重的泥土中粉正蚓樣品，并使用針對金屬硫蛋白的多克隆抗體對粉正蚓進行免疫染色實驗，發現金屬硫蛋白主要存在于粉正蚓體內的多孔結構中，與形似于溶酶體的物質共存。其分布主要在:腸表皮細胞的頂端細胞質里;與腸相連的臨近的胞腔中;腎管的狹窄管狀區域以及鈣腺的上皮細胞分泌物中。從上述研究結果中發現，金屬硫蛋白的分布與重金屬離子的分布具有高度的相似性，這也印證了金屬離子在粉正蚓體內是通過與金屬硫蛋白結合的方式進行蓄積、分布以及代謝的。

現代研究表明，MT是一類廣泛存在于生物界的低分子量、富含半胱氨酸的金屬結合蛋白，具有參與機體微量元素儲存、運輸和代謝、拮抗電離輻射、清除羥基自由基、重金屬解毒及參與激素和發育調節、增強機體應激反應等廣泛的生物學功能[14]。MT能結合汞、鎘、鉛等有毒重金屬離子，而且結合后就成為穩定的MT的一部分，從而使其失去對細胞的毒害作用。為驗證粉正蚓對鎘金屬離子的高度特異富集特性，Thanh T等[15]開展了對其金屬硫蛋白具體結合的研究，通過紫外吸收、圓二色譜和電噴霧電離質譜pH滴定實驗發現，20個半胱氨酸(Cys)的MT-2能夠與和7個Cd2+結合，而20個半胱氨酸分裂成了兩個分離的序列區域，其中11個 Cys在N氨基末端，9個Cys在C氨基末端。因此，鎘離子與MT-2的結合方式可以推斷為Cd3Cys9和Cd4Cys11。實驗顯示了粉正蚓MT與已知的其他的MT存在顯著的差異，也證實了粉正蚓的MT-2對鎘具有較大差異的“肽結合域”。

隨著分子生物技術的發展，人們越來越多地把研究目光放在了基因轉錄水平方面。現代研究對生物體代謝重金屬的基因調控模式研究主要集中在“谷胱苷肽再生說”以及“金屬硫蛋白合成說”，前者是使已與金屬結合過的谷胱苷肽迅速恢復其結合能力;而后者是通過上調wMTs編碼基因，誘導性產生大量的能與重金屬離子結合的MT[16]。“金屬硫蛋白合成說”無疑更符合人們對粉正蚓重金屬代謝模式的猜想。英國學者S.R.Stürzenbaum率先在粉正蚓的腸上皮和胚胎等組織成功分離出了3個隨重金屬濃度誘導性上調的wMTs編碼基因:wMT-1、wMT-2和wMT-3[3]，從而再次在基因層面為證實粉正蚓在重金屬富集方面采用金屬硫蛋白途徑的生物調控模式提供了確切的證據。

現代科學研究發現，重金屬對wMTs基因的誘導表達是一個嚴密而復雜的過程，它與MT基因功能區的調控作用有著緊密的聯系。基因誘導表達的一般過程為:生物體內預先存在一種或多種金屬效應轉錄因子 (Metal-responsive Transcription Factors，MTFs) ，當其與金屬離子結合后便誘導產生變構，進而與生物體內普遍存在的金屬應答元件MREs(Metal Responsive Elemen)[17]結合，對效應基因進行調控，促發MT的mRNA轉錄。而在MTs基因啟動子部分的多個調控部件中，MREs是唯一的能與金屬調節蛋白轉錄因子(MTF)靶向結合的基因調控元件[18]，而且是已知調控元件中最具特異性的介導重金屬對MT基因轉錄誘導的順式作用元件，是金屬元素控制基因轉錄的重要位點。

因此，研究MREs表達調控的過程及其分子調控機制，同時研究參與MT表達調控的各類因子，對其各自的作用進行分析比較，進一步尋找相應的反式調控因子，為實現在基因層面控制其對重金屬離子的富集或者加速其排泄尋求可能性，這對于本團隊研究在源頭上解決地龍藥材重金屬超標問題提供了重要的借鑒。

3 粉正蚓研究的應用前景

粉正蚓的基因研究成果能夠為我們在做進一步研究以及對相關物種開展研究提供高效的參照平臺。第7屆國際蚯蚓生態學座談會在粉正蚓基因研究信息普及共享方面作出了突出的貢獻。會議論述了EST(Expressed Sequence Tag，表達序列標簽，指一排從cDNA互補文庫中隨機產生并且提供一種方法能用于獲取大量編碼cDNA序列信息的簡短的單一的可閱讀序列)工程的進展，并對蚯蚓EST工程進展進行了一個簡要的概括:蚯蚓 EST工程發展非常迅速，對粉正蚓基因始端577個排序的分析能夠對應大約400種不同的基因，其中79種可以由兩個或多個EST來表述。已知蛋白具有顯著序列相似性而被發現的有76%，剩余的24%被歸類為新基因[19]。英國學者S.R.Stürzenbaum通過使用生物信息學工具，建造了一個蚯蚓序列信息的關系數據庫-LumbriBASE，通過互聯網界面(http://www.earthworms.org)，所有相關研究者均可以進行關鍵詞搜索和序列相似性比對，對于重金屬富集動物的相關研究起到了巨大推動作用。

21世紀人類的生產活動和全球工業化進程的加劇，世界許多國家和地區的空氣、土壤及水體面臨著越來越嚴重的重金屬污染的危害，重金屬在土壤中產生的污染具有隱蔽性、長期性和不可逆性等特點[20]，不但會嚴重影響動植物的產量與品質，更重要的是通過食物鏈或藥物危害人類的生命和健康。因此與土壤或水域相關的動植物系統中的重金屬污染成為評價動植物品質的重要指標，由于粉正蚓的普遍存在以及其重金屬富集特性，使它成為了世界上許多發達國家的生物研究、生態環境研究的動物研究模型[21]。近年有報道科學家在英國一處廢棄的礦井發現了變異的蚯蚓，這種蚯蚓能在被嚴重污染的有毒土壤環境中生存下來，并吃掉這些污染土壤的重金屬[22]。因而有科學家也開始研究粉正蚓的基因變異調節，從而

考慮把其可作為改善重金屬生態污染的重要解決手段[23]。而隨著藥學研究在利用蚯蚓提取物蚓激酶[24]、纖溶酶[25]等用于治療心臟病、腫瘤等常見疾病方面的發展，國內外對蚯蚓的應用也提升到一個新的平臺。解決食物鏈中的重金屬轉移，解決生態環境問題，解決臨床藥用安全等一切與人類生存密切相關的問題，都要求著我們對蚯蚓作出更深入和更全面的研究。

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R284.3

A

1007-4813(2010)05-0762-04

國家自然科學基金項目(No.30772741)，廣東省科技計劃項目(No.2007B020701004和No.2009B06070006)。

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李 薇，教授。E-mail:liwei-li@163.com.cn

2010-5-04)