苦瓜花藥培養(yǎng)研究進(jìn)展

唐懿，李萬寧，劉繼，鄭陽霞，李煥秀

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，四川雅安，625014；2.四川雙流縣農(nóng)村發(fā)展局）

苦瓜花藥培養(yǎng)研究進(jìn)展

唐懿1，李萬寧2，劉繼1，鄭陽霞1，李煥秀1

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，四川雅安，625014；2.四川雙流縣農(nóng)村發(fā)展局）

針對 影響苦瓜花藥培養(yǎng)的主要因素，如基因型、小孢子發(fā)育時(shí)期、生長環(huán)境、預(yù)處理、培養(yǎng)基、碳源、激素、添加物等進(jìn)行綜述，討論了目前苦瓜花藥培養(yǎng)中存在的問題，并為以后苦瓜花藥培養(yǎng)提供了研究方向。

苦瓜；花藥培養(yǎng)；研究進(jìn)展

苦瓜（Momordica charantiaL.）又名涼瓜，為葫蘆科苦瓜屬一年生蔓生植物，已有數(shù)百年的食藥兩用史，其營養(yǎng)豐富，抗壞血酸含量在瓜類蔬菜中最為突出，且性味苦寒，具有清心滌熱、明目解毒之功效，以及降血糖、抗菌、抗病毒等多重作用[1]，在廣大消費(fèi)者中頗受歡迎[2]。苦瓜在過去多為南方人喜愛，現(xiàn)也漸為北方人所接受，成為一種時(shí)尚蔬菜。利用保護(hù)地和露地栽培相結(jié)合，基本可保證四季供應(yīng)，不僅能滿足人們的消費(fèi)需要，也可使生產(chǎn)者獲得較高的經(jīng)濟(jì)效益[3]。

單倍體育種是從植物細(xì)胞培養(yǎng)中派生出的一種新育種技術(shù)，主要是利用植物的花藥誘導(dǎo)出單倍體植株，其優(yōu)點(diǎn)是獲得的純合二倍體后代性狀整齊一致，沒有普通雜交后代性狀參差不齊的分離現(xiàn)象，可免去漫長的多代選育鑒定過程，另外在雜合二倍體中表達(dá)不出的隱性基因均可在單倍體植株中表達(dá)，從而有利于發(fā)現(xiàn)植物的優(yōu)良性狀，提高育種效率。利用花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)單倍體具有十分重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。目前在大多數(shù)的瓜類蔬菜中已開展了這方面研究，但是成功的例子不多，而關(guān)于苦瓜的花藥離體培養(yǎng)方面的研究較少。

1 苦瓜離體培養(yǎng)研究概況

有關(guān)苦瓜的離體培養(yǎng)國內(nèi)外報(bào)道不多，現(xiàn)有的研究均處于初級階段。主要是利用苦瓜的無菌苗，取其子葉、真葉、下胚軸、莖尖和帶芽莖段等進(jìn)行組織培養(yǎng)，但效果均不理想。茍小平等[4]用苦瓜無菌苗幼葉分離的原生質(zhì)體，培養(yǎng)出了小愈傷組織，但未見有進(jìn)一步分化的報(bào)道。申洪業(yè)[5]對苦瓜的下胚軸進(jìn)行離體培養(yǎng)，只得到了愈傷組織。Islam等[6]進(jìn)行了苦瓜子葉離體培養(yǎng)研究，不定芽的再生頻率很低。王小榮等[7]利用苦瓜的子葉、真葉、下胚軸進(jìn)行試驗(yàn)，只在子葉上得到了不定芽，且誘導(dǎo)率不高。李靖[8]用苦瓜無菌苗的子葉誘導(dǎo)不定芽，誘導(dǎo)率也不高。唐琳等[9，10]利用無菌種子苗莖尖和帶芽莖段得到了增殖芽，但效果不理想。

2 瓜類花藥組織培養(yǎng)研究概況

西貞夫?qū)S瓜花藥培養(yǎng)進(jìn)行了研究，誘導(dǎo)出愈傷組織并分化出莖葉器官，開創(chuàng)了瓜類花藥培養(yǎng)的歷史先河[11]。陳偉等[12]分別對甜瓜花藥培養(yǎng)進(jìn)行了研究，經(jīng)愈傷組織分化成苗；陶正南[13]對甜瓜花藥進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)愈傷組織誘導(dǎo)獲得了完整的再生植株，但無有關(guān)再生植株倍性方面的報(bào)道。Sinha對普通絲瓜進(jìn)行花藥培養(yǎng)，誘導(dǎo)出愈傷組織。在西瓜的花藥培養(yǎng)中，薛光榮等[14]對2個(gè)西瓜品種的花藥進(jìn)行了愈傷組織誘導(dǎo)，獲得了花粉植株。Ashock Kumar等[15]使用2個(gè)黃瓜品種通過B5誘導(dǎo)和分化培養(yǎng)基進(jìn)行花藥培養(yǎng)獲得花粉再生植株。陳佳[16]對長白苦瓜進(jìn)行了愈傷組織誘導(dǎo)，但只得到不定根。瓜類花藥培養(yǎng)難度較大，誘導(dǎo)率太低，難以應(yīng)用于育種實(shí)踐。

3 花藥培養(yǎng)的影響因素

3.1 基因型

花藥對離體培養(yǎng)的反應(yīng)在很大程度上受到基因型的影響，不同基因型的植株對培養(yǎng)的反應(yīng)不同[17]。在瓜類蔬菜中，不同的種屬有不同的表現(xiàn)。黃瓜早在1971年就通過花藥培養(yǎng)獲得了不定芽[18]，哈密瓜、白蘭瓜（蘭州蜜瓜）、絲瓜、西瓜、甜瓜在此方面都有不同程度的研究，以西瓜花藥培養(yǎng)技術(shù)的研究最為成熟。在相同種屬的不同品種間，花藥培養(yǎng)也有不同的表現(xiàn)。謝淼等[19]的研究表明，取同一時(shí)期不同品種的黃瓜花藥均可誘導(dǎo)出愈傷組織，但誘導(dǎo)率不一樣，質(zhì)量也不一樣。在苦瓜的研究中也證實(shí)了這一點(diǎn)[20]。

3.2 小孢子發(fā)育時(shí)期

根據(jù)現(xiàn)今研究資料表明，產(chǎn)生單倍體的效率取決于多個(gè)因素，最關(guān)鍵的是取花藥時(shí)小孢子的發(fā)育時(shí)期。在黃瓜花藥培養(yǎng)中，西貞夫認(rèn)為不同發(fā)育期的花藥，均能形成愈傷組織[21]，而謝淼等[19]卻認(rèn)為，單核中后期的花藥作為外植體較適合。

何艷等[20]研究發(fā)現(xiàn)，單核中晚期的花藥愈傷誘導(dǎo)率最高。而甜瓜花藥培養(yǎng)的最佳時(shí)期是單核靠邊期到雙核期[22]，可見不同作物花藥培養(yǎng)要求的最適小孢子發(fā)育時(shí)期不同。在實(shí)際取材時(shí)可以根據(jù)花藥長度、花蕾大小、外觀形狀和色澤等與花粉發(fā)育進(jìn)程的相關(guān)性有目標(biāo)的直接采樣。

3.3 材料發(fā)育時(shí)期的生長環(huán)境

除小孢子發(fā)育時(shí)期外，材料發(fā)育時(shí)期的生長環(huán)境對花藥培養(yǎng)效果也有較大的影響。不同生長季節(jié)、栽培環(huán)境、不同部位的花蕾，其花粉的生理狀態(tài)可能均不同，誘導(dǎo)率也有明顯差異。謝淼等[19]發(fā)現(xiàn)，春季接種的黃瓜花藥表現(xiàn)的誘導(dǎo)效果比秋季的好。在西瓜花藥培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，開花前期的花藥，愈傷組織誘導(dǎo)頻率較高，且具有良好的分化潛力[23]。大白苦瓜的花藥培養(yǎng)，最佳取材時(shí)期為5～7月的陰天9：00～10：00[17]。

3.4 花藥的預(yù)處理

瓜類花藥培養(yǎng)中常用的預(yù)處理方式是4℃低溫處理，對于不同的種類、品種和生理狀態(tài)，要求的預(yù)處理時(shí)間不同。西瓜的合理處理時(shí)間為72 h[24]，甜瓜為36 h[22]，南瓜則為 4 d[25]，黃瓜處理 2 d的效果最佳[26]。4～7℃的低溫預(yù)處理都可以顯著地提高絲瓜愈傷組織的誘導(dǎo)率，且在4～8 d的時(shí)間范圍內(nèi)，處理時(shí)間越長，愈傷組織誘導(dǎo)率越高[27]。而苦瓜的花藥培養(yǎng)研究卻發(fā)現(xiàn)4℃預(yù)處理出現(xiàn)負(fù)效應(yīng)，即愈傷組織誘導(dǎo)率隨著預(yù)處理時(shí)間的延長而逐漸下降，以未經(jīng)過預(yù)處理的花藥愈傷組織誘導(dǎo)率最高，預(yù)處理天數(shù)達(dá)4 d時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率大幅下降[28]。

3.5 基本培養(yǎng)基

大多數(shù)的瓜類花藥培養(yǎng)都用MS作為基本培養(yǎng)基。謝淼等[19]選用了MS和B5對黃瓜花藥進(jìn)行培養(yǎng)，原式瓊采用N6的大量元素、MS的微量元素作為分化培養(yǎng)基進(jìn)行哈密瓜的花藥培養(yǎng)，而董艷榮[22]在甜瓜花藥培養(yǎng)中則以MS-KI作為培養(yǎng)基，即增加1倍Fe-EDTA、Mg2SO4·7H2O和VB1。此外也有選用N6進(jìn)行絲瓜離體培養(yǎng)，還有利用不同基本培養(yǎng)基改良后的組合進(jìn)行瓜類離體培養(yǎng)，而苦瓜花藥培養(yǎng)一般以MS作為培養(yǎng)基。

3.6 碳源

所有瓜類花藥培養(yǎng)的研究試驗(yàn)中，以蔗糖作為碳源的試驗(yàn)較多，但針對碳源進(jìn)行比較的試驗(yàn)較少。大多研究發(fā)現(xiàn)，蔗糖作為碳源比葡萄糖或麥芽糖更利于苦瓜花藥愈傷組織的誘導(dǎo)[17，20]。

3.7 激素

激素的水平和配比通常對誘發(fā)細(xì)胞的分裂，生長和分化起著決定作用。西貞夫認(rèn)為在不含生長素的培養(yǎng)基上幾乎不會形成愈傷組織。在瓜類花藥愈傷組織誘導(dǎo)過程中，BA是一個(gè)關(guān)鍵因素。大多數(shù)的瓜類花藥培養(yǎng)試驗(yàn)表明，在基本培養(yǎng)基中添加BA均能誘導(dǎo)出愈傷組織，配合2，4-D和KT使用效果更好[29]，且BA在愈傷組織分化過程中也起著重要作用。此外，NAA也有利于愈傷組織的誘導(dǎo)，但濃度不宜過高，董艷榮[22]認(rèn)為最好不超過0.05 mg/L。在黃瓜花藥培養(yǎng)中，低濃度的KT，NAA和2，4-D配合可使愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)100%[20]。在西瓜的花藥培養(yǎng)中，使用高濃度的GA3、BA和腺嘌呤或再添加500 mg/L的水解乳蛋白，可誘導(dǎo)愈傷組織快速分化出植株，若添加三十烷醇或BA可加快分化出正常植株[24，30]。馬劉峰等[31]認(rèn)為，2，4-D在誘導(dǎo)甜瓜花藥由愈傷組織形成胚性細(xì)胞團(tuán)的過程中起了重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，苦瓜花藥愈傷組織生根比較容易，這可能是由于苦瓜中內(nèi)源生長素比較高，但是未見誘導(dǎo)出芽的報(bào)道[16，20]。

3.8 培養(yǎng)條件

適宜的溫度和光照對愈傷組織的誘導(dǎo)和生長都非常重要[32]。瓜類的花藥培養(yǎng)溫度比其他種類蔬菜要高一些，一般白天為25～30℃，夜間則稍低[33]。當(dāng)培養(yǎng)溫度為28℃時(shí)，黑暗條件下可誘導(dǎo)出具有胚性細(xì)胞的甜瓜花藥胚性愈傷組織[34]。在苦瓜中還沒有針對不同培養(yǎng)條件而進(jìn)行的比較試驗(yàn)。

3.9 活性炭

活性炭可以吸收培養(yǎng)基及花藥本身產(chǎn)生的抑制物質(zhì)，對一些蔬菜的花藥培養(yǎng)是有益的。但有關(guān)活性炭對瓜類花藥培養(yǎng)的影響報(bào)道較少，只有喻財(cái)鈴[27]研究指出，活性炭對絲瓜花藥培養(yǎng)的效果差，有抑制作用。

4 問題及展望

苦瓜的單倍體育種還處于起步階段，存在很多問題需要解決。第一，盡管愈傷組織誘導(dǎo)率得到了提高，但小植株的誘導(dǎo)沒有成功，只獲得了少量不定根。第二，有關(guān)苦瓜花藥培養(yǎng)的研究太少，缺乏系統(tǒng)、全面、深入的研究。

根據(jù)苦瓜易形成愈傷組織而不宜分化不定芽的特點(diǎn)，針對花藥及其誘導(dǎo)出的愈傷組織中內(nèi)源激素的含量方面進(jìn)行研究，分析其規(guī)律性，為苦瓜花藥培養(yǎng)外源激素的添加提供一定的理論依據(jù)。

對于苦瓜花藥培養(yǎng)得到的較豐富的愈傷組織材料，可比較其形態(tài)結(jié)構(gòu)特征，結(jié)合切片觀察等技術(shù)，及時(shí)篩選出有可能成為胚性的愈傷組織類型，有針對地進(jìn)行誘導(dǎo)。

花粉（小孢子）培養(yǎng)是另外一條獲得單倍體的途徑，該途徑能避免花藥壁對單倍體形成的抑制作用，克服嵌合體現(xiàn)象。因此，有必要加強(qiáng)該方面的研究。

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Progress on Anther Culture in Balsam Pear(Momordica charantiaL.)

TANG Yi1,LI Wanning2,LIU Ji1,ZHENG Yangxia1,LI Huanxiu1
(1.College of Horticulture,Sichuan Agricultural University,Sichuan,Ya'an 625014; 2.Countryside development office,Shuangliu,Sichuan)

Anther culture is an important breeding technique in vegetable crops.The factors affecting anther culture of balsam pear,such as genotype,growth phase of microspore,growth environment of material,pretreatment,medium,carbon source,plant growth regulators,medium additions were summarized.The future research direction was put out according to existing problems in balsam pear anther culture.

Balsam pear;Anther culture;Progress

10.3865/j.issn.1001-3547.2010.24.002

四川農(nóng)業(yè)大學(xué)青年科技創(chuàng)新基金（003309）

唐懿（1984-），女，在讀博士研究生，研究方向?yàn)閳@藝植物育種與生物技術(shù)，E-mail：tangyisunguochao@sina.com

李煥秀，通信作者，E-mail：hxli62@163.com

2010-01-15