Caspase家族對大腸癌影響研究進展

王小敏 佟樹文 鄭素琴

(華北煤炭醫學院基礎部病理學教研室 河北 唐山 063000)

腫瘤細胞增殖與凋亡的失衡是腫瘤發生和發展的重要環節。細胞凋亡調控失敗，會引起細胞(尤其是基因突變細胞)過度增殖或凋亡減少，從而增加細胞惡變的潛能導致腫瘤發生。Caspase家族蛋白酶的激活在細胞凋亡過程中起著關鍵作用，當其凋亡不足時，易發生癌變、病毒性疾病和自身免疫性疾病等。本文就Caspase對大腸癌的影響綜述如下。

1 Caspase蛋白酶及其生物學特征

Caspase全稱為半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶(cysteinyl aspartate specific protease)，主要以酶原的形式廣泛存在于細胞中，一般位于胞質，偶見于胞核。目前在哺乳動物細胞中已發現Caspase蛋白酶家族成員有16種，按其發現的先后順序在Caspase后以阿拉伯數字表示。在細胞凋亡中起重要作用的主要有 caspase－8、caspase－9、caspase－3。根據 Caspase結構同源性、功能和底物特異性的不同，分為三大類:凋亡啟動組，包括Caspase－2、－8、－9和－10，通過自身活化啟動凋亡并調節效應型Caspase;凋亡執行組，包括Caspase－3、－6和－7等，能分解細胞蛋白，執行凋亡;炎癥反應組，包括Caspase－1、－4、－5、－11、－12、－13和－14等，其活化與炎癥因子的合成有關。另有人依據種系發生的結果分析將Caspase分為3個亞家族:Caspase－1亞家族，包括 Caspase－1、－4、－5、－11、－12、－13和－14;Caspase－2亞家族，只有Caspase－2一個成員;Caspase－3亞家族，包括 Caspase－3、－6、－7、－8、－9和 －10。

Caspase蛋白酶家族具有以下共同特點:①均屬于半胱氨酸蛋白酶;②均以無活性的酶原形式存在于細胞中;③均含有五肽保守序列 QACXG(Caspase－9X=G，Caspase－8和 Caspase－10X=Q外，其余Caspase家族成員X=R);④活化后具有獨特的催化活性，將底物在ASP位點后切斷，同時通過這種方式也能自我活化;⑤可直接或間接地被鈣離子激活，過度表達都可導致一系列不可逆轉的蛋白質裂解，最終導致細胞死亡;⑥底物的特異性，即對底物序列的特異性識別，因而酶促反應具有高度特異性;⑦轉染不同細胞可誘導凋亡。

2 Caspase的作用底物

Caspase家族在凋亡發生的DNA裂解、細胞形態等方面起著核心作用，激活的Caspase通過對細胞特異性蛋白質的剪切達到快速有序的“殺死”細胞，將凋亡信號逐級傳至凋亡底物。目前已有40多種Caspase底物得到發現。根據蛋白酶對其底物酶切后產生作用的后果不同，將其底物分為四大類:第一類是被酶切后活化的底物，如Caspase本身切割可引起自身活化，PKC－δ、P21激活的激酶2(PAK2)、凝脂酶A2、類固醇調節組件結合蛋白(SREBF)等;第二類為酶切后失活的底物，如DNA催化亞單位、視網膜母細胞瘤抑制蛋白等;第三類為酶切后改變其結構的蛋白，如A型和B型細胞核Lamin及Gas2;第四類為酶切后對凋亡作用尚不清楚的底物PARP[poly(Aop－ribose)polymerase]DNA－PAKs等。

3 Caspase激活途徑

3.1 死亡受體途徑 又稱細胞外途徑。死亡受體(death receptor，DR)是一類跨膜蛋白，隸屬于腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor receptor，TNFR)超家族。目前發現至少有8種死亡受體在細胞凋亡信號的傳導過程中發揮作用，主要包括Fas/CD95、TNFR －1、DR －3、－4 和 －5、誘騙受體(Decoy receptor，DcR)等。Fas分子的配體為FasL;TNFR－1配體為TNF－α;DR3為APO－3L，而 DR4H 和 DR5配體為 TRAL、APO－2。當靶細胞表面的配體與各自的受體結合后，膜上的受體就會發生二聚化，存在于胞漿中的結構域就會發生改變，導致死亡結構域(death domain，DD)與連接蛋白(fas－associated death domain protein，FADD)C末端的DD結合，形成誘導死亡信號復合物(death－inducing signal complex，DISC)，從而激活 Caspase－8或Caspase－10，繼而活化下游的執行者Caspase－3和Caspase－7，啟動Caspase的級聯反應，導致細胞凋亡[1]。

3.2 線粒體途徑 又稱細胞內途徑。隨著研究的深入，人們發現線粒體在細胞凋亡中發揮著重要的作用，細胞色素C從線粒體內釋放是關鍵的一步，在凋亡發生早期線粒體膜電位下降而通透性增加，線粒體內的各種蛋白質被釋放出來，包括細胞色素c、細胞凋亡誘導因子(apoptosis inducing factor，AIF)、Smac/DIABLO、EndoG等。當細胞的凋亡啟動后，Bax蛋白由胞液轉至線粒體膜上，細胞色素C從構建的孔隙中進入胞液，在dATP的協助下，Apaf－1發生活化，與pro－Caspase－9分子中的CARD結構域寡聚化，形成凋亡小體(apoptosome)，促使pro－Caspase－9自身活化，活化的Caspase－9進一步激活下游的Caspase－3、－6和－7等，進而引發Caspase級聯反應導致細胞凋亡[2]。線粒體自身也含有一定量的Caspase，受凋亡信號刺激時會釋放出來，線粒體內部釋放的pro－caspase－3直接參與凋亡信號的轉導，由此推測可能存在一個Caspase和線粒體自身反饋的環，凋亡刺激導致線粒體細胞色素C、AIF、Smac、Caspase釋放，Caspase的活化又促進誘發這一過程，對于凋亡的加速和凋亡信號傳遞有十分重要的意義。

3.3 內質網信號途徑 Caspase－12啟動Caspase的第三條途徑，即內質網(endoplasmic reticulum，ER)信號途徑，是近年來研究發現的又一條重要的Caspase激活途徑。內質網應激誘導Caspase－12表達，同時也導致胞質中的Caspase－7轉移到內質網表面。Caspase－7激活Caspase－12，激活的 Caspase－12由內質網胞質面移位至細胞質與激活的Caspase－9結合，啟動ER stress誘導細胞凋亡的Caspase級聯反應[3]。

Caspase介導的細胞凋亡是一種錯綜復雜的生理及病理現象，細胞外途徑導致 Caspase－8的活化，細胞內途徑導致Caspase－9的活化。無論何種途徑，最終Caspase－3被激活，活化的Caspase－3裂解相應的胞漿胞核底物，導致細胞凋亡[4]。兩條凋亡途徑能發生交叉對話，即通過死亡受體途徑激活的Caspase－8剪切Bid，從而激活Bid，使細胞色素C從線粒體釋放激活Caspase－9[5]。Caspase激活除上述的三種主要途徑外，還可能有其它的激活方式，各種途徑之間也并非完全孤立地發揮作用，細胞的最終命運就在于上述各種信號途徑相互作用的結果。

4 Caspase家族的調控

一級調控:Caspase主要以無活性的酶原形式存在;二級調控:Bcl一2家族及SMAC/DABLO調節procaspase的蛋白水解活化;三級調控:活化的Caspase受IAp家族的調控。這些調控蛋白在腫瘤中通常存在異常表達，因此可以作為腫瘤治療的靶點。

5 Caspase與大腸癌

癌癥是多基因控制的疾病。近年的研究表明，細胞凋亡和增殖的平衡破壞為腫瘤的發生發展提供了平臺[6，7]。凋亡異常導致本該死亡的細胞被保留下來，其中有些突變的細胞增殖失控，形成腫瘤。目前關于Caspase對大腸癌影響研究較多的主要有以下幾種類型:

5.1 Caspase－1與大腸癌 Caspase－1是Caspase家族中最重要的一員，是炎癥反應過程的關鍵效應分子。多項研究表明，通過Caspase補充區域(cARD)，以CARD/CARD途徑與銜接蛋白Asc特異性結合原Caspase－1，能使其活化，進一步介導致炎性細胞因子IL－1和IL－18等的成熟與活化，從而引起炎癥反應[8]。

江興林等應用免疫組化法對30例結腸癌標本及相應的癌旁組織進行Caspase－l檢測，陽性率分別為60%(18/30)和3O%(9/30)，組間陽性表達率有非常顯著性差異(P＜0.05)，提示Caspase－1在結腸癌的凋亡、發生及發展過程中有重要作用[9]。

5.2 Caspase－3與大腸癌 Caspase－3是是哺乳類動物細胞凋亡的關鍵蛋白酶，是凋亡執行的重要效應分子，被稱為死亡蛋白酶。它一般以23ku的無活性前體存在于細胞質中，當細胞進入凋亡時才被激活，參與多種因素誘導的細胞凋亡。

曾浩然等采用免疫組化法和原位末端標記法分別檢測28例大腸癌、10例大腸腺瘤及5例正常大腸黏膜中Caspase－3基因的表達水平及細胞凋亡，結果顯示Caspase－3基因在大腸癌、大腸腺瘤和正常黏膜組織中的表達分別為46.4%(13/28)、60.0%(6/10)和80.0%(4/5)，三者之間有顯著性差異(P ＜0.01)[10]。與鄧文英等[11]的研究結果一致，提示 Caspase －3 基因參與了大腸癌的發生及去分化過程。Larmonier等研究得出大鼠的結直腸癌組織在脂質A的誘導下激活Caspase－3基因，促進了腫瘤細胞的凋亡，而引起腫瘤的退化[12]。

5.3 Caspase－8與大腸癌 Caspase－8主要在胚胎早期起作用，Caspase－8基因甲基化、基因突變及其它表達異常與某些腫瘤、自身免疫性疾病的發生有關。結直腸癌組織及多種腫瘤細胞系檢測到Caspase－8基因突變，并表現出凋亡受損[13]。Kim等檢測到結直腸癌中Caspase－8基因突變率為5.1%，腫瘤來源的突變體表現出明顯減弱的凋亡活性[14]。

5.4 Caspase－9與大腸癌 Caspase－9屬于上游起始Caspase，主要在內源性細胞凋亡途徑中活化，從而激活效應Caspase－3導致細胞凋亡。Caspase－9普遍表達于神經、肌肉、肝臟、脾臟、肺和胃等正常組織[15]。有研究表明，在胃癌、皮膚黑色素瘤和白血病中都發現Caspase－9基因轉錄和翻譯水平的下調[16]。

沈小鋼、韓崢等采用RT－PCR測定大腸癌組織及癌旁組織中Caspase－9mRNA的表達，結果顯示與癌旁組織比較，Caspase－9在大腸癌中表達下調，二者差異有顯著性(P＜0.05)。提示Caspase－9在大腸癌的發病中參與了腫瘤組織的分化[17，18]。

5.5 Caspase－14與大腸癌 栗琴應用免疫組化法檢測大腸組織中Caspase－14的表達，Caspase－14在正常組、腺瘤組、高分化腺癌組、中分化腺癌組、低分化腺癌組中的陽性表達率分別為95%、90%、58%、30%和25%，多組間比較差異有統計學意義(P ＜0.001)，分化程度越低，Caspase－14 表達越低[19]。與Krajewska等的報道一致[20]。

除 Caspase－1、3、8、9 和 14 外，Caspase凋亡通路中其它組份與大腸癌的相關性及Caspase通路對大腸癌的具體作用機制還需進一步研究。

大腸癌是一個多因素、多階段、多基因變異所致的疾病，多種癌基因的激活和抑癌基因的失活及正常凋亡機制的紊亂在這一過程中起著重要的作用。近年來對促細胞凋亡基因的深入研究已成為分子腫瘤學的一個熱點。Caspase家族是細胞凋亡調控的關鍵分子群，它們通過切斷與周圍細胞的聯絡、重組細胞骨架、關閉DNA復制和修復、破壞DNA和核結構，誘導凋亡小體的形成。明確其機制及調控過程，無疑是防治腫瘤和其它疾病研究的重要方面。正是由于Caspase在細胞凋亡機制中的重要作用及其特性，針對它們來進行凋亡保護以及凋亡調控機制的研究日益廣泛。相信隨著對Caspase系統研究的深入，Caspase上游基因和下游的作用底物及各種協作因子將一一被闡明，促Caspase因子和拮抗因子將制成藥品推向市場，對有關疾病產生細胞凋亡獨特機制的深入了解，有可能用于某種腫瘤和某種疾病的治療，從而開辟基因治療的新領域。

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