水稻矮稈基因定位和克隆的研究進(jìn)展

詹慶才,肖子發(fā)

（1.中南大學(xué)研究生院隆平分院，湖南 長(zhǎng)沙 410125；2.湖南省水稻研究所生物技術(shù)研究室，湖南 長(zhǎng)沙 41025）

1 水稻矮稈性狀的研究現(xiàn)狀

水稻諸多性狀中，矮稈是研究最早和最多的性狀之一，水稻的半矮稈化也是育種最重要的成果之一。20世紀(jì)60年代起全世界范圍內(nèi)以作物矮化育種為標(biāo)記的“綠色革命”使作物的產(chǎn)量得到了大幅度的提高。

1.1 水稻矮稈性狀的遺傳研究

從廣義上講，水稻的矮生性是指成熟期水稻株高比正常植株縮短的遺傳特性。經(jīng)典遺傳學(xué)表明水稻株高既屬于數(shù)量性狀，又表現(xiàn)為質(zhì)量性狀遺傳。在秈稻中，矮稈遺傳主要受1個(gè)隱性半矮稈基因控制（sd1），遺傳力較高，與高稈品種雜交后代呈高稈和矮稈的雙峰分布，并且大多數(shù)半矮稈秈稻品種的半矮稈基因均為sd1的復(fù)等位基因。在粳稻中，矮稈遺傳與秈稻相似，但根據(jù)控制矮稈的基因?qū)?shù)可以將粳稻矮稈品種分為兩類(lèi)，一類(lèi)由單個(gè)矮稈主效基因控制，另一類(lèi)由多個(gè)矮稈微效基因控制，而且控制粳稻矮稈的主效基因一般為非等位關(guān)系[1-2]。

20世紀(jì)末，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，利用分子標(biāo)記對(duì)控制水稻株高性狀進(jìn)行QTL檢測(cè)，將對(duì)水稻矮稈性狀遺傳研究從經(jīng)典遺傳學(xué)的水平深入到分子水平，為最終闡明水稻矮稈的遺傳機(jī)制奠定了基礎(chǔ)[3]。1986年日本的水稻基因符號(hào)、命名和連鎖群委員會(huì)將矮稈基因統(tǒng)一定名。具有強(qiáng)矮化效應(yīng)、植株表現(xiàn)為矮稈（狹義）類(lèi)型的基因定名為d系統(tǒng)，而具有較弱矮化效應(yīng)、植株表現(xiàn)為半矮稈類(lèi)型的基因定名為sd系統(tǒng)，根據(jù)被鑒定的時(shí)間順序，從1往后排[4]。目前，已分別注冊(cè)到d-62和sd-8，其中部分矮稈（半矮稈）基因是相同的或等位的；例如，d-6和d-34，d-10、d-15和16，d-11和d-8，d-12和d-50，d-14和d-10，sd-1和d47分別是等位的。

1.2 水稻植株矮化機(jī)制研究

水稻植株矮化是矮稈主基因表達(dá)作用的結(jié)果，同時(shí)也受到修飾基因或抑制基因的影響[5]。一般認(rèn)為矮稈基因的作用能直接導(dǎo)致水稻植株形態(tài)學(xué)或細(xì)胞學(xué)的變化，如節(jié)間變短和細(xì)胞個(gè)數(shù)減少，從而使植株變矮；同時(shí)，基因的表達(dá)還受到外部環(huán)境和內(nèi)源條件的影響。

1.2.1 水稻植株矮化與節(jié)間或細(xì)胞長(zhǎng)度、數(shù)目的關(guān)系20世紀(jì)80年代前，有關(guān)水稻矮稈機(jī)理的研究主要集中在外部形態(tài)。由于細(xì)胞的生長(zhǎng)和功能決定植株器官的結(jié)構(gòu)和功能，分析水稻植株的矮化機(jī)理有必要進(jìn)行細(xì)胞學(xué)的研究。Kamijima等[6]通過(guò)對(duì)許多等基因矮稈系的研究，發(fā)現(xiàn)節(jié)間長(zhǎng)度與細(xì)胞數(shù)目呈高度正相關(guān)，而與細(xì)胞長(zhǎng)度無(wú)顯著相關(guān)性，表明節(jié)間的縮短可能是細(xì)胞數(shù)目減少的結(jié)果。

1.2.2 水稻植株矮化與溫度的關(guān)系部分矮稈基因?qū)λ局仓甑陌捵饔门c溫度存在相互作用。此外，攜帶矮稈基因d58的植株在低溫條件下生長(zhǎng)時(shí)表現(xiàn)矮稈小粒，在高溫條件下則表現(xiàn)正常[7]。

1.2.3 水稻植株矮化與植物激素的關(guān)系水稻的生長(zhǎng)和發(fā)育主要受到六類(lèi)植物激素的調(diào)節(jié)，它們分別是生長(zhǎng)素（Auxin），赤霉素（GA）、細(xì)胞分裂素（Cytokinin）、脫落酸（ABA），乙烯（Ethylene）和油菜素幽醇（BRs）。6種激素中，GA與植物株高性狀關(guān)系最密切[8]。目前已克隆的矮稈基因有Sd1和D18，分別編碼赤霉素合成途徑中的關(guān)鍵酶GA20-氧化酶和GA3-氧化酶[9]。如d1突變體，目前d1基因已經(jīng)克隆，它編碼一個(gè)G蛋白α亞基，參與了GA的信號(hào)傳導(dǎo)[10]。

近年來(lái)的研究表明水稻矮化也與BR的合成及其信號(hào)傳導(dǎo)受阻有關(guān)。在擬南芥中已經(jīng)克隆到5個(gè)與BR合成相關(guān)的基因（Dim，Cpd，Dwarf1，Dwar4和Dwarf7）以及2個(gè)與BR傳導(dǎo)相關(guān)的基因Bri1和Bri2分別編碼一個(gè)富含亮氨酸的蛋白激酶以及一個(gè)GSK3/SHAGGY類(lèi)似的激酶[11-12]。在水稻中也克隆到了2個(gè)與BR合成相關(guān)的基因OsBR6ox和D2以及1個(gè)與BR傳導(dǎo)相關(guān)的基因Osbri1[13-14]。

1.3 水稻矮化材料的利用研究

中國(guó)秈型矮源在全球秈稻矮化育種中起到了啟動(dòng)和關(guān)鍵作用。除中國(guó)大陸外，低腳烏尖幾乎是所有矮化品種的共同祖先。粳稻的矮生性以日本最早開(kāi)始研究，主要矮源有農(nóng)林8號(hào)、農(nóng)林1號(hào)、農(nóng)墾58、藤坂5號(hào)、石狩白毛和金南風(fēng)；意大利品種巴利拉（Balilla）也是粳稻育種的主要親本。在水稻中己鑒定了d1至d61共55個(gè)矮稈基因，但只有“d47”（即sd1）在水稻育種中發(fā)揮了作用。同一矮稈基因的廣泛利用潛藏著由遺傳單一帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)。因而發(fā)掘、鑒定和利用新矮源應(yīng)成為當(dāng)今水稻育種中的重要研究?jī)?nèi)容[15]。

2 水稻基因精細(xì)定位與克隆

隨著擬南芥和水稻基因組的測(cè)序完成，一個(gè)重要的目標(biāo)就是鑒定和克隆在農(nóng)藝生產(chǎn)上有價(jià)值的基因。目前主要的策略是采用圖位克隆法以及利用突變體和生物信息學(xué)。

2.1 圖位克隆的原理

克隆基因最經(jīng)典的方法就是圖位克隆法。圖位克隆法主要包括4個(gè)基本技術(shù)環(huán)節(jié):目的基因的初步定位；精細(xì)定位；目的基因所在區(qū)域物理圖譜的構(gòu)建；篩選cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)并進(jìn)行功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)。其中目的基因的精細(xì)定位是圖位克隆策略中最艱苦和最耗時(shí)的限速步驟。利用混合樣品作圖可以有效地提高精細(xì)定位的效率[16]。

2.2 圖位克隆的應(yīng)用

隨著水稻高精密遺傳圖譜和物理圖譜的相繼構(gòu)建成功[17]，尤其是全基因組測(cè)序結(jié)果的公布[18]，為水稻基因的精細(xì)定位以及后續(xù)的圖位克隆創(chuàng)造了優(yōu)越的條件。早期在水稻中克隆的兩個(gè)抗白葉枯病基因和兩個(gè)抗稻瘟病基因均是利用圖位克隆戰(zhàn)略完成的[19-20]。最近報(bào)道的一些水稻基因的圖位克隆則是以突變體為材料，如矮稈基因d1、d2、單分蘗基因Moc1和脆稈基因BC1[21]。Ashikari等[10]從13000個(gè)F2植株中選取了3185個(gè)矮稈植株，應(yīng)用RFLP和STS等分子標(biāo)記將d1基因定位于0.15 cM的小區(qū)域內(nèi)，并應(yīng)用EST最終克隆d1基因。

以QTL為起點(diǎn)的圖位克隆則相對(duì)于主基因的克隆更為困難一些，主要是由于QTL的效應(yīng)一般都較小又受基因組背景的調(diào)節(jié)，且易受環(huán)境的影響。1996年Alpert和Tanksley首次在番茄中克隆了控制果重的QTL[22]。迄今，最為成功的例子莫過(guò)于日本研究人員對(duì)一系列水稻抽穗基因的克隆:Hd1、Hd3a和Hd6[23]。

2.3 生物信息學(xué)的應(yīng)用

隨著擬南芥和水稻基因組的測(cè)序完成以及數(shù)據(jù)的釋放，生物信息學(xué)越來(lái)越凸現(xiàn)出其重要性。當(dāng)目的基因精細(xì)定位到一定小的區(qū)域時(shí)，候選基因的確定就非常關(guān)鍵了。應(yīng)用生物信息學(xué)可以快速、省時(shí)和準(zhǔn)確地確定目的基因。Li等[24]將單分孽基因Moc1精細(xì)定位到約20 kb的小區(qū)間，通過(guò)基因注釋?zhuān)l(fā)現(xiàn)在20 kb的小區(qū)間里有一個(gè)編碼蛋白與番茄的Lateral Supperssor（LS）蛋白高度同源。

對(duì)QTL的克隆同樣依賴(lài)于生物信息學(xué)。在QTL精細(xì)定位甚至是初步定位的基礎(chǔ)上，利用生物信息學(xué)提取眾多的預(yù)測(cè)基因，并通過(guò)對(duì)性狀及生理生化等的分析，從而可以確定候選基因，最終克隆基因。Ishimaru等[25]就利用日本晴及其一個(gè)近等基因系NIL-6，在QTL初步定位的基礎(chǔ)上分離和鑒定了一個(gè)控制株高的基因，位于第1染色體長(zhǎng)臂上的一個(gè)淀粉合成相關(guān)基因:蔗糖磷酸合酶（SPS）。

2.4 突變體資源的應(yīng)用

2.4.1 T-DNA直接插入法T-DNA利用其轉(zhuǎn)移特性插入到植物基因組中。T-DNA插在基因組不同的部位造成各種插入結(jié)果。由于多數(shù)突變性狀是由隱性基因決定的，因此一旦確定了突變性狀和T-DNA是連鎖的，就可以通過(guò)獲得旁鄰序列，從而得到被標(biāo)簽的功能基因。

2.4.2 轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)插入法由于轉(zhuǎn)座子的特殊特性（它的插入會(huì)引起基因突變，而當(dāng)它割離之后基因的功能又可以恢復(fù)），可以將它作為一個(gè)插入突變?cè)?，用?lái)克隆因?yàn)檗D(zhuǎn)座子插入而失活的基因。

2.4.3 逆座子標(biāo)簽法逆轉(zhuǎn)座子被認(rèn)為與基因的復(fù)制和基因的表達(dá)調(diào)控相關(guān)。當(dāng)植物染病、創(chuàng)傷或是在組織培養(yǎng)時(shí)都會(huì)發(fā)生逆轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座。

2.4.4 增強(qiáng)標(biāo)簽法因?yàn)檎Ｇ闆r下基因產(chǎn)物的數(shù)量是限定的，必須與其他產(chǎn)物達(dá)到平衡?；虍a(chǎn)物的不足或過(guò)量都會(huì)破壞這種平衡，并表現(xiàn)出生長(zhǎng)與發(fā)育的異常。該標(biāo)簽系統(tǒng)在T-DNA的右邊界附近加入多個(gè)串聯(lián)的啟動(dòng)子，促使細(xì)胞中某一基因過(guò)量表達(dá)。

根據(jù)突變體的表型，利用生物信息學(xué)可以查找擬南芥以及其它禾本科作物中已經(jīng)克隆到的基因，通過(guò)序列的比對(duì)，在水稻中找到一些同源基因，繼而進(jìn)行基因的克隆與功能研究。最新報(bào)道的一些水稻基因就是通過(guò)這種策略完成的，如d18、Osbri1和OsBR6ox[26]。Mori等[14]獲得一個(gè)單隱性矮稈突變體后，通過(guò)表型的觀察、外源激素的處理以及內(nèi)源激素含量的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)矮稈是由于BR合成的一個(gè)關(guān)鍵酶BR-6-氧化酶缺失引起的，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)的查找，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與番茄中編碼BR-6-氧化酶的Dwarf基因以及擬南芥BR6ox基因同源的EST，野生型和T2代突變體DNA序列的測(cè)定驗(yàn)證了缺失和插入引起了移碼并造成了的OsBR6ox的功能缺失。

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