低溫植酸酶產生菌鑒定及其酶學性質初步研究

陳 璨，遲乃玉，王 鑫，董 碩，張慶芳*

（1.大連工業大學生物工程學院，遼寧大連，116034；2.大連大學生物工程學院，遼寧 大連 116622；3.遼寧省海洋微生物工程技術中心，遼寧 大連 116622）

植酸酶（phytase）是催化植酸及植酸鹽水解成磷酸 （或磷酸鹽）和肌醇的一類酶[1]。其來源廣泛，在微生物、動物、植物中都有發現[2]。由于植酸酶可解決植酸帶來的環境及營養問題，已經成為食品、酶制劑及飼料添加劑研究的熱點[3]。現在應用的植酸酶大多是中溫和高溫酶，最適酶溫度一般為44℃～60℃[4]，在較低溫環境中效果達不到最佳。而低溫植酸酶表現出在較低溫條件下（0℃～30℃）催化活力高、酶的最適作用溫度低等特征。特別是在當今世界資源及能源危機的情況下，低溫植酸酶可以有效的利用有機磷（植酸及植酸鹽），降低能耗，節約能源。目前，國內外對產低溫植酸酶菌株的研究較少。本研究分離出一株產低溫植酸酶的菌株，進行了初步鑒定；并初步研究了其酶學性質。

1 材料與方法

1.1 菌株

酵母菌CZC0208：分離于渤海灣，保藏于大連大學生物工程學院發酵工程實驗室。

1.2 培養基

分離培養基：植酸鈣0.10%、葡萄糖5.00%、NH4NO30.40%、KCl 0.05%、MgSO4·7H2O 0.05%、瓊脂1.50%、蒸餾水100mL、pH5.5。

保藏培養基：PDA培養基[5]。

液體發酵培養基：葡萄糖5.00%、蛋白胨1.00%、硫酸銨0.30%、KCl 0.05%、MgSO4·7H2O 0.05%、蒸餾水100mL、pH5.5。

1.3 菌株分離

將樣品按一定比例稀釋后涂布于分離培養基上，在15℃培養3d～5d，保藏產生透明圈的菌株。

1.4 菌種鑒定

1.4.1 形態學分析

觀察菌落形態、顏色、直徑以及用光學顯微鏡觀察細胞形態等，進行分析[6]。

1.4.2 ITS序列分析

利用UNIQ-10柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒提取樣品的基因組DNA，ITS 區段的擴增采用引物1（ITS1：5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3'）和引物2（ITS4：5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3'）。PCR反應體系（50μL）：模板1μL，引物1 1.0μL，引物2 1.0μL，dNTP S 1μL，Pfu Buffer 5.0μL，Pfu 酶0.25μL，補加雙蒸水到50μL。擴增程序為98℃雙鏈預變性5min；95℃變性30s，54℃復性25s，72℃延伸45s，進行35個循環；72℃延伸4min。以CZC0208DNA為模板，利用ITS rDNA通用引物進行PCR，產物經瓊脂糖凝膠電泳后回收。PCR回收產物由生工生物工程（上海）有限公司進行測序。將測得的ITS區rDNA基因核苷酸序列輸入GenBank數據庫，進行blast比對，獲取與CZC0208 ITSrDNA基因序列相似度高的菌種。采用Clustal X進行多序列匹配比對，通過Mega4.1軟件計算出序列的系統進化距離，Neighbor-Joining法構建系統進化樹，系統發育樹評估采用自舉法（Bootstraping），自舉次數設置為1000次。

1.5 酶活力測定

酶活測定方法[7]：植酸酶活力定義為每分鐘水解1nmol無機磷所需的酶量為1個酶活性單位（U/mL）。

1.6 溫度對酶活的影響測定

按照植酸酶的測定方法，在不同溫度，分別測定其降解植酸鈉的能力，并根據所得數據繪圖。

2 結果與分析

2.1 菌種篩選

利用分離培養基從采自渤海灣的樣品中篩選出3株能夠產生低溫植酸酶的酵母菌，其中一株命名為CZC0208，挑取CZC0208少許點種于分離培養基上，在15℃培養3d～5d后得到單菌落，有較明顯透明圈。

2.2 菌種鑒定

2.2.1 菌株形態學鑒定

植酸酶產生菌菌落特征和菌體形態見附表。

附表 菌落特征和菌體形態Attached table.Colony characteristics and cellular morphology

挑取少許分離純化后的菌體，進行美蘭染色，結果見圖1。

圖1 菌株形態Figure 1.Morphology of strain CZC0208

根據菌落及細胞形態，初步鑒定該菌株為酵母菌。

2.2.2 菌株ITS rDNA的序列分析與系統發育樹的構建

該菌株ITS rDNA經測序其長度為372bp。

從GenBank中下載與CZC0208的ITS相似性高的菌株的ITS序列，進行系統發育樹分析，結果見圖2。

由圖2系統發育樹表明，CZC0208與Dipodascussp.Ccre7（AF481862.1）在同一分支上，同源性為99%。與CNY0820系統發育比較密切的菌株還有：Galactomyces geotrichum（DQ189222.1）、Geotrichumsp.Po67（AY513953.1）、Geotrichumsp.Po4-mu（AY211069.1）、Dipodascaceaesp.LM380（EF060694.1）、Galactomycesgeotrichum（AJ279445.1）、Dipodascus australiensis（AF157596.1）。因為菌株CZC0208與Dipodascussp.Ccre7同源性最高，達到99%，所以初步鑒定為Dipodascus（雙足囊菌屬）。CZC0208的ITSrDNA序列：

圖2 鄰接法構建的菌株CZC0208的ITS的系統發育樹Figure 2.Phylogenetic tree based on ITS rDNA gene sequences of CZC0208

2.3 低溫植酸酶的最適溫度

在不同溫度條件下，分別測定粗酶液降解植酸鈉的能力，結果見圖3。

由圖3可以看出，15℃～35℃時植酸酶活力逐步上升，當溫度為35℃時，酶的活力達到最高點，酶活為90.17U/mL。隨著溫度升高，酶活力又逐步下降。表明在20℃～30℃時，有一定的催化活力，其最適溫度為35℃。

3 小結與討論

圖3 溫度對低溫植酸酶的影響Figure 3.Effect of temperature on activity of phytase

從渤海灣分離出一株產低溫植酸酶的菌株，命名為CZC0208，由菌落特征和菌體形態以及ITS rDNA的序列分析與系統發育樹的構建結果可初步鑒定菌株CZC0208為酵母菌，屬于雙足囊菌屬（Dipodascus）。該菌所產植酸酶活力在35℃時達到最大，較中溫及高溫植酸酶最適作用溫度低。

植酸酶可以催化水解反應將磷酸鹽從植酸中釋放出來，提高磷利用率，降低環境中的磷污染[8]，并可以消除植酸的螯合作用，促進動物對礦質元素的吸收。此外植酸酶還是一種新型食品添加劑和制備藥用肌醇磷酸酯的催化劑。有關低溫植酸酶的研究尚處于起步階段，主要集中在菌種選育、發酵條件優化、相關基因克隆以及酶學性質的研究等方面[9]。

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[6]魏景超.真菌鑒定手冊[M].上海：上海科學技術出版社，1979.

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