胃萎寧膠囊對(duì)萎縮性胃炎伴腸上皮化生抑癌基因蛋白表達(dá)的影響

陸 敏 王德明 王 焱 田耀洲 夏軍權(quán) 朱方石 王春如 滑永志(江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院消化科,江蘇南京 210028)

胃黏膜腸上皮化生作為癌前病變,與胃癌發(fā)生有密切聯(lián)系,目前尚無(wú)療效滿意的治療藥物。本研究采用復(fù)方植物藥制劑——胃萎寧膠囊治療慢性萎縮性胃炎伴腸上皮化生患者40例,探討其對(duì)患者抑癌基因蛋白PTEN和p16表達(dá)的影響。

1 資料與方法

1.1 研究設(shè)備 Olympus H260型前視式高清晰電子胃鏡,CV-260型全數(shù)字電子內(nèi)鏡影像處理機(jī),德國(guó)Zeiss公司Microm-340E型石蠟切片機(jī),英國(guó)Shandon公司 Hypercenter-XP組織脫水機(jī),英國(guó)Shandon公司 Histocentre-2型組織包埋機(jī),HPLAS-1000高清晰彩色病理圖文報(bào)告管理系統(tǒng)。

1.2 研究試劑 均為丹麥Dako公司產(chǎn)品。PTEN試劑:Mouse-Anti-Human,Clone:28H6,Code NO:GT201002。p16試劑:Mouse-Anti-Human,Clone:6H12,Code NO:GT201310。

1.3 研究藥物 胃萎寧膠囊,每粒0.4 g,由江蘇省現(xiàn)代中藥制劑工程技術(shù)研究中心提供,批號(hào):蘇藥制字Z04000321。

1.4 研究對(duì)象 萎縮性胃炎伴腸上皮化生患者共40例,其中男性28例,女性12例,年齡平均59.4±11.6歲。診斷標(biāo)準(zhǔn)按2006年中華醫(yī)學(xué)會(huì)消化病學(xué)分會(huì)制定的《中國(guó)慢性胃炎共識(shí)意見(jiàn)》。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),所有研究對(duì)象知情同意。

1.5 研究方法

1.5.1 治療方法 萎縮性胃炎伴腸上皮化生患者均口服胃萎寧膠囊,4粒,每日 3次(餐后),療程60 d。治療前后均行電子胃鏡及病理檢查。

1.5.2 腸上皮化生HE染色 胃黏膜活檢標(biāo)本均常規(guī)用10%中性甲醛固定,石蠟包埋,HE染色并切片,依據(jù)固有腺體萎縮程度、黏膜肌層增厚、腸上皮化生、固有膜炎癥、淋巴濾泡形成來(lái)檢測(cè)。

1.5.3 免疫組化檢測(cè) 胃黏膜標(biāo)本共80個(gè)(40對(duì))。石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化,PBS漂洗,浸泡于3%H 2 O2(20 min)阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,PBS(0.05 mmol?L-1,pH 7.4)洗 3次 ,每次5 min。組織切片置于10 mmol?L-1枸櫞酸鈉(pH 6.0)溶液,微波爐中沸騰 10 min,冷卻到室溫,用 PBS(0.05 mmol?L-1,p H 7.4)洗 3次,每次 5 min。滴加正常山羊血清封閉液,室溫 20 min。加入試劑,陰性對(duì)照用0.05 mmol?L-1PBS代替一抗。4℃過(guò)夜。用 PBS(0.05 mmol?L-1,p H 7.4)洗 3次,每次5 min。滴加生物素化二抗,20～37℃20 min,用 PBS(0.05 mmol?L-1,p H 7.4)洗3次 ,每次5 min。滴加試劑SABC,20～37 ℃20 min,用PBS(0.05 mmol?L-1,pH 7.4)洗 3次,每次5 min。8DAB顯色,蒸餾水洗終止反應(yīng)。

1.5.4 結(jié)果判斷 細(xì)胞漿內(nèi)見(jiàn)棕褐色顆粒染色為陽(yáng)性。每個(gè)切片選5個(gè)高倍視野,按陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占同類細(xì)胞總數(shù)的百分比來(lái)計(jì)算?！?%為陰性(-),6%～25%為表達(dá)陽(yáng)性(+),26%～50%為表達(dá)顯著陽(yáng)性(++),＞50%為表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。并以各細(xì)胞表達(dá)強(qiáng)度積分:(-)為0分、(+)為1分,(++)為2分,(+++)為3分。觀察染色情況,并進(jìn)行各組染色強(qiáng)度積分統(tǒng)計(jì)。

1.5.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SAS 6.12軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用優(yōu)效性分析,治療前后療效等級(jí)比較采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。所有假設(shè)檢驗(yàn)采用雙側(cè)檢驗(yàn),P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

萎縮性胃炎伴腸上皮化生患者,口服胃萎寧膠囊治療后胃黏膜抑癌基因蛋白第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶與張力蛋白的同源物基因(PTEN)的表達(dá)上調(diào)(P＜0.01);抑癌基因蛋白p16表達(dá)也上調(diào),但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.564)(表1,圖1和圖2)。

表1 抑癌基因蛋白表達(dá)結(jié)果(n=40)

3 討 論

慢性萎縮性胃炎與胃癌發(fā)病關(guān)系密切,目前公認(rèn)的模式為:慢性萎縮性胃炎→胃黏膜腸上皮化生→胃黏膜不典型增生(上皮內(nèi)瘤變)→胃癌。其過(guò)程與多基因改變有關(guān),包括原癌基因的激活和抑癌基因的失活、原癌基因的擴(kuò)增及癌基因產(chǎn)物的過(guò)度表達(dá)。

胃萎寧膠囊為國(guó)家名老中醫(yī)王德明所創(chuàng),以益氣健脾、行瘀化痰為治則,在臨床已應(yīng)用12年余,頗有良效,具有較完整的制作工藝和藥理學(xué)、毒理學(xué)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)[1]。本研究采用胃萎寧膠囊治療慢性萎縮性胃炎伴腸上皮化生,并探討了其對(duì)抑癌基因蛋白PTEN與p16的作用。結(jié)果顯示治療前后患者胃黏膜抑癌基因蛋白PTEN的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而抑癌基因蛋白p16的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明胃萎寧膠囊作為植物藥復(fù)方制劑,其多途徑、多靶點(diǎn)效應(yīng)的本質(zhì),可能與其上調(diào)抑癌基因蛋白PTEN的表達(dá)相關(guān)。

PTEN基因是第1個(gè)被發(fā)現(xiàn)的具有雙重特異性磷酸酶活性的抑癌基因,已經(jīng)證實(shí)PTEN基因的表達(dá)水平與多數(shù)消化系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有關(guān)[2]。大量研究證據(jù)表明PTEN是一個(gè)強(qiáng)有力的抑癌基因,其突變頻率可以與p53相匹敵,這些特點(diǎn)使其成為p53之后最引人注目的一種抑癌基因。

PTEN基因的生物學(xué)功能主要包括以下兩個(gè)方面:(1)在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和凋亡中的作用;(2)與細(xì)胞粘附、鋪展和遷移行為有關(guān)。細(xì)胞黏附力下降為腫瘤轉(zhuǎn)移前提之一,黏著斑(focaladhesion kinase,FAK)為整合蛋白信號(hào)分布于黏著斑復(fù)合物,FAK表達(dá)的增加和活化在細(xì)胞遷移中具有重要作用,而重組PTEN可使FAK體外脫磷酸化。Kang等[3]采用具甲基化特異性PCR檢驗(yàn)了PTEN的甲基化狀況,在310例胃癌標(biāo)本中,62例(20%)免疫組化示PTEN表達(dá)缺失,這種改變與腫瘤的浸潤(rùn)深度、大小、淋巴浸潤(rùn)、進(jìn)展期及患者的生存率有很大的關(guān)聯(lián)。

PTEN基因被稱為后p53時(shí)代突變最多的抑癌基因[4]。PTEN基因表達(dá)缺失可促進(jìn)胃癌血管生成,并在胃癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用,其表達(dá)在胃癌的發(fā)生、進(jìn)展、生長(zhǎng)、分化和血管生成中起重要作用。胃萎寧膠囊上調(diào)了抑癌基因蛋白PTEN的表達(dá),促使腸上皮化生逆轉(zhuǎn),達(dá)到抑制胃癌發(fā)生的目的。

腸上皮化生的發(fā)病機(jī)制尚處于探索階段,幽門(mén)螺旋桿菌毒力因子、腸道特異性轉(zhuǎn)錄因子、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性等均參與其發(fā)病環(huán)節(jié),單獨(dú)根除幽門(mén)螺旋桿菌似乎不足以逆轉(zhuǎn)腸上皮化生,聯(lián)合應(yīng)用其他化學(xué)阻斷劑以及中醫(yī)藥,可能是一條新的治療途徑。而且腸上皮化生和萎縮常呈灶狀分布,有限的幾點(diǎn)活檢標(biāo)本的代表性以及多次活檢的部位差異性等都可能對(duì)最后結(jié)果產(chǎn)生影響,幽門(mén)螺旋桿菌定標(biāo)活檢技術(shù)(marking targeting biopsy,MTB)的應(yīng)用可增加診斷及治療效果評(píng)價(jià)的準(zhǔn)確性[5]。

總之,胃萎寧膠囊治療萎縮性胃炎伴腸上皮化生有臨床療效,其機(jī)制可能與其調(diào)控抑癌基因蛋白PTEN的表達(dá)相關(guān)。但其有效成分復(fù)雜,對(duì)原癌基因的擴(kuò)增及抑癌基因的作用還需進(jìn)一步深入探討。

1 陸 敏,王德明,王春如,等.胃萎寧膠囊治療萎縮性胃炎伴腸上皮化生的臨床研究[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2008,14(9):21-23.

2 常曉華,姜愛(ài)民,張 超,等.大腸癌中Survivin、PTEN、p16的表達(dá)及其臨床意義[J].中國(guó)臨床醫(yī)學(xué),2007,14(1):31-32.

3 Kang YH,Lee HS,Kim WH,et al.Promoter methy lation and silencing of PTEN in gastric carcinoma[J].Lab Invest,2002,82(3):285-291.

4 Park GS Jo YE,Kim HS,et al.Expression of PTEN and its correlation with angiogenesis in gastric carcinoma[J].Korean JGastroenterol,2005,46(3):196.

5 Si JM,Sun LM,Fang YJ,et al.Trial of a novel end oscopic tattooing biopsy forceps on animai model[J].World J Gastroenterol,2005,11(12):1859-1861.