果蔬中農藥殘留速測技術的應用與發展

王潔蓮，張子倫

（山西省農產品質量安全檢驗監測中心，山西太原030001）

在我國，果蔬中農藥殘留試驗開始于20世紀60年代，最早采用的是容量法和比色分析法。隨著科學技術的進步及儀器設備的改進，20世紀80年代普遍采用氣相色譜、高效液相色譜、氣—質聯用色譜等先進儀器進行分析。目前，國內外農藥殘留快速檢測技術主要包括生物檢測、生化檢測和化學檢測三大類，其中，生物檢測主要指采用生物活體分析的方法，生化檢測主要包括酶抑制法、免疫分析法、生物傳感器等方法，化學檢測主要是儀器分析法。目前果蔬中農藥殘留檢測方法應用最廣泛的是儀器分析法和以酶抑制法為基礎研制的各種快速檢測工具。儀器分析法的定性定量檢測，靈敏度高、結果相對正確，但投資大、檢測時間長、對人員技術要求高，不利于現場監測。而利用酶抑制法這一原理生產的各種快速檢測儀正在越來越多地進入各地蔬菜基地、批發市場等，已成為我國農藥殘留快速檢測的主流技術。

1 生物檢測技術

1.1 發光菌檢測法

農藥與細菌作用后可影響細菌的發光程度，不同種類的發光細菌的發光機制相同[1]，即由分子氧作用，胞內熒光酶催化，將還原態的黃素核甘酸（FMNH2）及長鏈脂肪醛氧化為FMN及長鏈脂肪酸，同時釋放出最大發光強度在波長450～490 nm的藍綠光。常用的發光菌有弧菌屬和發光桿菌屬的一些細菌，但是發光菌被激活后，它的發光強度會隨時間的變化而改變。因此，實際分析時，必須選擇發光變化率較小的時間來測試。發光菌檢測法只對少數藥劑有反應，無法辨別殘留農藥的種類，準確性較低。所以，該法在食品安全檢測中的應用還不多見。

1.2 敏感家蠅檢測法

農藥殘留會導致家蠅中毒[2]。使用敏感品系的家蠅為材料，用樣本喂食敏感家蠅后，根據家蠅死亡率便可測出農藥殘留量。使用家蠅檢測蔬菜中的農藥殘留，過程簡單，農戶可自行檢測。而此項技術的最早應用在臺灣，其局限性為需要繁殖大量的敏感性家蠅，前期準備工作比較復雜。該法只對少數藥劑有反應，無法分辨殘留農藥的種類，準確性較低，且僅適于田間未采收的蔬菜。另一方面，由于近年來農藥種類急增，而家蠅等檢測生物對毒性較低的合成擬除蟲菊酯類農藥十分敏感，使對殘留農藥的判斷產生一定的困難，影響生物檢測法的實際效果和應用。

2 生化檢測技術

2.1 酶抑制法

酶抑制法是我國農藥殘留快速檢測技術中應用最多也相對成熟的一種殘留快速檢測技術，特別是以酶抑制法為基礎研制的各種速測工具，成為儀器分析法的有效補充。目前，酶抑制法應用較為廣泛的是膽堿酯酶抑制法，用于測定有機磷和氨基甲酸酯類農藥殘留。將該酶與樣品提取液反應[3]，如果存在上述2類農藥，酶活性會受到抑制，顯色后吸光度與沒有這2類農藥存在時不同。基于這一原理，已開發出速測箱、速測卡、快速測定儀等多種類型的產品。

2.1.1 速測箱法 速測箱法是基于膽堿酯酶可催化靛酚乙酸酯（紅色）水解為乙酸和靛酚（藍色）[4]，有機磷和氨基甲酸酯類農藥對膽堿酯酶有抑制作用，使催化、水解、變色的過程發生改變。將膽堿酯酶與樣品提取液反應，若膽堿酯酶未受到抑制，基質水解產生藍色，表明樣品提取液中不含有機磷和氨基甲酸酯類農藥（呈陰性）；若膽堿酯酶受到抑制，基質就不能水解，不變色，表明樣品中含有有機磷和氨基甲酸酯類農藥（呈陽性）。該方法對常見農藥的檢出限量大都高于相應農藥的最大殘留限量，因此，其只能作為定性的快速初篩檢測法。

2.1.2 速測卡法 農藥速測卡中一般含有白色和紅色2種藥片[5]。白色藥片中含有膽堿酯酶，它是一種由蛋白質分子構成的生物催化劑，主要分布于動物體神經傳導組織，專門催化神經傳導介質乙酰膽堿的水解反應。紅色藥片中含有乙酰膽堿類似物靛酚乙酸酯，靛酚乙酸酯在膽堿酯酶的催化下可迅速發生水解反應，生成靛酚（藍色）和乙酸。只要有微量有機磷或氨基甲酸酯類農藥存在，就能強烈地抑制藍色產物的產生，靠目測就可從藍色的深淺來判斷農藥的殘留。對呈陽性結果的樣品，可用其他分析方法進一步確定具體農藥的品種和含量。

2.1.3 速測儀[6]趨于市場的需求，近年來各種快速檢測儀已成為我國農藥殘留快速檢測的主流技術。其原理是：殘留農藥對乙酰膽堿酯酶活性有抑制作用，濃度越高，抑制率越高，通過儀器測定酶與底物、顯色劑顯色反應的變色速率，并與空白對照比較求得酶抑制率，從而判定農藥殘留量是否超標。

2.1.4 傳感器法 它是將傳感技術與農藥免疫分析技術相結合而建立起來的方法，是免疫分析技術的一種延伸或分支。在農藥殘留速測分析上應用的有生物傳感器法和同相傳感器法。

2.1.4.1 生物傳感器法[7]生物傳感器是由一種生物敏感部件與轉換器緊密配合，對特定化學物質或生物活性物質具有選擇性和可逆響應的分析裝置，通過測定pH和電導等物理化學信號的變化，即可測得農藥殘留量。其存在的主要問題是分析結果穩定性差，重現性不好，使用壽命短。但此方法在我國還主要停留在研究開發階段。

2.1.4.2 同相傳感器法[8]通常用壓電結晶，即當附加電壓時，晶體震動的能力取決于晶體的質量和大小，而晶體上包被了能吸附目標物的材料，當晶體配基接觸時就會發生吸附，隨之晶體的質量和頻率發生變化。頻率的改變與吸附在晶體上的物質的含量有關，以此進行定量測定。

2.2 免疫分析法（IA）

免疫分析法又叫酶免疫吸附分析法，是基于抗原抗體特異性識別和結合反應為基礎的分析方法，包括放射性免疫分析法、酶聯免疫分析法、熒光免疫法、免疫膠體金法、多組分分析物免疫分析法、流動注射免疫分析法、免疫傳感器分析法等，最為常用的是酶聯免疫分析法。

2 2.1 放射性免疫分析法（RIA） 它是起步比較早的一種免疫分析法，是將抗血清與待測農藥在試管中培育一定的時間后，加入同位素標記的待測農藥，該同位素標記農藥和待測農藥競爭，并

與抗體發生結合反應，再采用適當的方法將被抗體結合的和未被抗體結合的標記農藥分離，則未被抗體結合的放射性標記農藥留在了溶液中。待測農藥含量越大，則標記農藥被抗體結合的量就越少，游離的標記農藥就越多，溶液中的放射強度就越大。因此，待測農藥的含量與反應后溶液中的放射強度成正比，根據放射強度即可得待測物含量。

2.2.2 酶聯免疫分析法（EIA） 它是以抗原與抗體的特異性、可逆性結合反應為基礎的農藥殘留檢測方法，具有專一性強、靈敏度高、快速、操作簡單等優點。試劑盒可用于大量樣品的現場快速檢測，定性、定量準確，但該法對試劑的選擇性很高，很難同時分離多種成分，并對結構類似的化合物也有一定的交叉反應。

2.2.3 流動注射免疫分析法（FIIA[9]）它是最新的農藥殘留檢測技術，適用于連續測定和大流量樣品的測定，更易于實現自動化，能更快速、靈敏地測出結果。FIIA所需時間由EIA的1.5 h縮短至6.5 min。FIIA的不足之處是：變異系數大，需要1次性裝膜的柱子抗體，且酶標的半抗原使用量大，1次只能檢測1個樣品。最近，但德忠等綜合了熒光免疫分析、光纖傳感器、流動注射、免疫磁珠分離4項先進技術，建立起一種新型熒光光纖免疫磁珠流動分析系統。該系統既可進行普通的熒光分析、動力學熒光流動分析，又可進行熒光光纖免疫流動分析。該分析法比EIA更靈敏，標記物也不易失活，與RIA相比無放射性污染。免疫磁珠集吸附、富集、分離等功能于一體，結合流動分析停留技術和可控電磁場，可在分離過程中完成抗體（抗原）結合態和游離態標記物的自動在線分離，避免一般流動免疫分析中柱的再生和膜的更換。

2.2.4 熒光免疫分析法（FIA） 它是將抗血清、待測農藥、熒光標記的待測農藥混合在聚苯乙烯管中，經培育后加入卜球蛋白和分子量為6 000的聚乙二醇，使與之結合的待測農藥和熒光標記的待測農藥沉淀下來；未被結合的熒光標記的待測農藥留在上清液中。當抗血清與熒光標記待測農藥的量一定時，含待測農藥多的試管中，抗體結合的熒光標記的待測農藥較少，上清液中游離的熒光標記的待測農藥就多，即待測物含量與游離的熒光標記物含量成正比，測定上清液的熒光強度，即可算出待測物含量。Eremin報道了一種快速的熒光偏振光免疫分析（PFIA）。PFIA是一種基于熒光標記的半抗原與特異性抗體結合后半抗原的熒光極性增強的檢測手段。若樣品中含有未標記的被測物，它就會與抗原競爭與抗體結合，從而使極性信號降低。這種PFIA技術不需要對樣品進行任何濃縮或沖洗，可直接分析。

2.2.5 多組分分析物免疫分析法（MIA）[10]它是指在同一份樣品中，同時測定2種或2種以上的相關分析物的免疫分析技術。MIA的原理是在被測物中加入由不同標記物標記的抗原或半抗原的混合物，用競爭法測定各自對應抗原的含量。目前常用的標記物有放射性物質、酶和熒光素等物質。

2.2.6 免疫分析技術及其他分析技術的聯用單獨使用IA獲得的信息量少，而理化分析方法的選擇性差。將免疫分析法和理化分析法聯合起來使用，可使整個分析方法簡化，進一步提高檢測效率。液相色譜法（LC）與免疫分析法（IA）的聯用，將LC的高分離能力和IA的高靈敏性、高特異性融為一體。LC-IA分析法尤其適合多組分殘留分析和微量分析。免疫分析與氣相色譜—質譜（GC-MS）的聯用可減少結構相似的農藥或代謝產物分析中的交叉反應，降低假陽性。

3 化學檢測技術

化學檢測主要是運用儀器分析的方法。儀器分析法結果準確可靠，是農藥殘留檢測中最經典、最常用的分析方法，但因其技術含量高、操作程序相對復雜，且需要特定的實驗條件和具有一定專業技術的人員進行操作，一般不適用現場檢測，以下為幾種常見的儀器分析方法。

3.1 與色譜分析相關的檢測方法

3.1.1 氣相色譜法（GC） 它是一種經典的分析方法。近年來，毛細管柱氣相色譜廣泛應用于揮發性農藥殘留測定。其檢測器有電子捕獲檢測器（ECD）、火焰光度檢測器（FPD）、氮磷檢測器（NPD）、原子發射檢測器（AED）、質譜檢測器（MSD）等。NPD是測定有機磷和氨基甲酸酯等農藥的常用檢測器；AED不僅可檢測目標化合物表中所列的農藥，而且還可檢測幾百種農藥及代謝物。氣相色譜法適用于多種樣品一次進樣，得到完全分離以及定性和定量測定。

3.1.2 高效液相色譜法（HPLC） 它是以液體作為流動相的色譜分析法，主要用于高沸點、熱穩定性差、相對分子質量大的農藥的分離和分析。由于只能檢測對紫外線有吸收和本身能發射熒光的農藥，因而限制了其應用范圍。

3.1.3 薄層色譜法（TLC） 它是利用被檢測物經顯色后同標準物質比較來定性、用薄層掃捕儀來定量的測定方法。薄層色譜法顯色反應類型多，顯色劑范圍廣，快速，不受物質限定，因此，它特別適用于揮發性較小或較高溫度易發生變化而不能用氣相色譜分析的農藥殘留。

3.1.4 超臨界流體色譜法（SFC） 它是以超臨界流體作為流動相的色譜分析技術，可在較低溫度下分析分子量較大的化合物。對熱不穩定的化合物和極性較強的化合物，其可與各種氣相、液相色譜檢測器匹配，還可與紅外、質譜聯用。

3.1.5 色譜—質譜聯用法（GC-MS） 凡能用氣相色譜法進行分析的樣品，大部分都能用該法進行定性及定量測定。但隨著農藥殘留限量要求的進一步提高以及樣品基質的影響，該技術的應用也受到了一定的限制。

3.1.5.1 氣相色譜—串聯質譜儀聯用法（GC-MS） 它是以離子阱為質量分析器的離子阱串聯質譜儀，靈敏度高。目前，該技術不僅適用于復雜基體混合物的定性分析，而且可以利用得到的二級質譜結果進行定量，但是其僅能檢測目標分析物，很難一次進樣分析大量化合物。

3.1.5.2 液相色譜—質譜聯用法（LC-MS） 可用于易揮發、熱不穩定、分子量較大、難以用氣相色譜分析的化合物的檢測。它具有檢測靈敏度高、選擇性好、定性定量同時進行、結果可靠等優點。該方法具備多殘留分析的能力，用于初級監測呈陽性反應的樣品的確證（初級監測呈陽性反應的樣品檢測不出農藥種類，而用上述方法可確定農藥的種類），優勢明顯。

3.2 直接光譜分析法

近紅外衰減傘反射光譜技術和表面增強拉曼光譜技術使光譜分析的靈敏度提高102～107倍。直接光譜技術所需樣品量極少，具有很大的應用潛力。目前，衰減全反射—傅里葉變換紅外光譜聯用法監測農殘的靈敏度高于透射光譜法，具有快速、簡便、檢樣量少、無需預處理等優點。

3.3 毛細管電泳（CE）

CE的作用原理是使用毛細管柱內的不同帶電粒子在高壓場作用下以不同的速度在背景緩沖液中定向遷移，從而進行分離。它具有靈敏度高、耗資少、樣品消耗量小、使用方便等優點，但其進樣量少，檢測光程短，濃度檢測限較高。

4 實驗室自動化分析法

使用實驗室機器人進行農藥殘留分析也進入研究階段，研制方便、靈活、運行速度快、體積小的實驗室機器人，制定標準化的實驗方法，將是未來的現代化實驗室的發展方向。

5 結語

儀器分析法的定性定量檢測，靈敏度高、結果相對正確，但投資大、檢測時間長、對人員技術要求高，不利于現場監測，而在殘留分析技術中其地位仍是不可取代的。利用酶抑制法這一原理生產的各種快速檢測儀、速測卡等正在越來越多地進入各地蔬菜基地、批發市場等，已成為我國農藥殘留快速檢測的主流技術，特別是快速檢測儀的運用已日趨廣泛。同時，新的檢測方法不斷涌現，特別是多殘留的同時測定及單個農藥在多種樣本中的測定都取得了重要進展，且檢測方法也向簡便、快捷、靈敏度高的方向發展。

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