MMP-2靶向 RNAi質(zhì)粒的構(gòu)建及其對小鼠巨噬細胞 MMP-2表達的沉默作用

王 政,李為民,周宏艷,郭虹鳳,孫文學(xué)

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院,哈爾濱 150001)

RNA干擾(RNAi)是一種進化上保守的抵御轉(zhuǎn)基因或外來病毒侵犯的防御機制,是指內(nèi)源性或外源性與靶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 mRNA存在同源互補序列的雙鏈 RNA(dsRNA),在細胞內(nèi)特異地降解該mRNA,是一種序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)[1]。 RNAi具有快速、有效、容易操作和序列特異性強等優(yōu)點[2]。肺間質(zhì)纖維化是一種進行性加重的彌漫性肺疾病,可造成肺結(jié)構(gòu)與功能不可逆損傷[3]。近年發(fā)現(xiàn),基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)在肺纖維化的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[4]。2009年 9～11月,我們設(shè)計了能轉(zhuǎn)錄小發(fā)卡結(jié)構(gòu) RNA(shRNA)的DNA序列,并與 psiSTRIKETM質(zhì)粒載體連接,構(gòu)建受控于人 RNA聚合酶Ⅲ啟動子 U6的真核表達載體,以脂質(zhì)體法將重組質(zhì)粒導(dǎo)入小鼠巨噬細胞內(nèi),觀察該質(zhì)粒對小鼠巨噬細胞 MMP-2表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 psiSTRIKETMU6載體,小鼠巨噬細胞系RAW264.7,限制性內(nèi)切酶 Pst I,質(zhì)粒小量提取試劑盒,凝膠回收試劑盒,LipofectamneTM2000轉(zhuǎn)染試劑,總 RNA提取試劑盒,cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒,RPMI-1640培養(yǎng)基,山羊抗鼠 MMP-2抗體,FITC-兔抗山羊IgG。

1.2 方法

1.2.1 MMP-2特異性 siRNA的設(shè)計 從 GenBank中選取小鼠MMP-2基因序列,采用 siRNA Target Designer-Version 1.51設(shè)計軟件設(shè)計 2對 MMP-2基因發(fā)卡寡核苷酸,序列符合 siRNA表達載體 psiSTRIKETMU6的要求。DNA序列片斷由上海生工公司合成。

1.2.2 MMP-2 siRNA表達載體的構(gòu)建 1μg/μl人工合成單鏈核苷酸在退火緩沖液中,90℃ 3 min后緩慢降到室溫。與 5μl快速連接緩沖液、1μl psiSTRIKETM載體(50 ng/μl)、2 μl Nuclease-Free水和 1μl T4 DNA連接酶(3 U/μl)配制成連接反應(yīng)液,室溫培養(yǎng) 1 h。加入 100μl E.coli JM109感受態(tài)細胞中,冰浴。加入 400μl室溫的 LB培養(yǎng)液,37℃振蕩培養(yǎng)(50 r/min)45 min。200μl轉(zhuǎn)化液涂在LB/氨芐西林平板上鋪板,37℃過夜培養(yǎng)。……