非組培遺傳轉化法在農作物上的應用

任海紅，任小俊，王 英，劉學義

（1.山西省農業科學院經濟作物研究所，山西汾陽032200；2.汾陽中學，山西汾陽032200）

自1983年第1例轉基因植株成功獲得以來，植物基因工程研究進入了蓬勃發展時期。轉化技術方法已發展到20種左右，如農桿菌介導法、花粉管通道法、基因槍法、電擊法、PEG法、顯微注射法等，其中最理想的技術仍是農桿菌介導技術。

利用轉基因技術培育轉基因植物，主要的目的是培育抗病蟲、抗除草劑、抗旱、耐鹽堿的優質農作物新品種。轉基因技術突破了物種的界限，可以將動物、微生物的有益基因轉化到植物中。目前，已有一系列轉基因作物品種形成，如抗蟲棉、抗蟲玉米、抗蟲水稻、抗除草劑大豆、抗白葉枯病水稻等。植物基因工程技術在農作物品種改良和育種方面發揮著越來越重要的作用。

目前，植物遺傳轉化所采用的受體系統，大都依賴于細胞組織培養技術才能獲得轉基因植株。但由于組培周期長并存在一定的局限性，因而近年來發展起來一些非組培的轉化方法。本文著重對幾種非組培轉化方法的技術原理及其在農作物上的應用進行了介紹，并對今后的發展方向進行了展望。

1 幾種非組培轉化方法的原理及其應用

1.1 真空滲透法

真空滲透法是一種原位真空滲入遺傳轉化方法。1993年，Bechtold等首先在擬南芥的轉化中獲得成功。該方法主要步驟為:在開花早期將擬南芥花浸入含農桿菌菌液的液體培養基中，然后用真空泵抽真空處理，再恢復常壓，使農桿菌菌液滲入到植物組織內部。真空處理之后植株處于一種極度衰弱的狀態，需平放于高濕環境中進行恢復性生長，然后轉栽于正常生長條件下，收獲種子，篩選、檢測轉基因植株。

Bechtold等建立了整株（in planta）原位真空滲入遺傳轉化方法，此后許多學者在擬南芥[1]和蕓薹屬的一些作物[2]上進行了大膽嘗試。李曉等[3]以棉花花粉作為受體細胞，在農桿菌介導下將外源基因導入花粉中，然后通過人工授粉獲得轉化。它避開了傳統基因轉化方法所需的組培過程，含外源基因的花粉可與卵細胞自然結合，產生的轉化體不存在轉化與非轉化細胞間的嵌合現象。

真空滲透法轉化植物不需經過組織培養即可直接獲得轉化的種子，易于重復，可靠性高。目前，真空滲透法在擬南芥、白菜、油菜等的遺傳轉化中應用較多[4-5]。實驗中，植物發育階段、抽真空的強度和時間、農桿菌的濃度對轉化效率都有影響。

1.2 Floral-dip法

Floral-dip法是在擬南芥真空滲透法的基礎上發展起來的。在植株的花蕾期，將花序浸漬在含有表面活性劑的工程農桿菌菌液中，經表面活性劑的吸附和滲透作用，強化和刺激細胞的轉化。

Clough等[6]首先在擬南芥中用浸蘸法轉化獲得成功。后來，Chung等[7]對擬南芥花序進行了農桿菌菌液直接噴霧（floral-spray）處理，同樣獲得了轉化株，這是比Floral-dip法更為簡便的轉基因方法。在作物方面，劉琦[8]用此方法將CYCD2基因導入小麥中，進行了有意義的嘗試。暢乃迪[9]嘗試采用農桿菌介導的Floral-dip轉化法，在大田中首次對玉米雄花進行遺傳轉化，并獲得了成功。王翠艷等[10]首次運用Floral-dip法將植酸酶基因轉入冀豆12，獲得遺傳轉化率為1.18%～2.22%。雖然此方法在作物方面的應用并不是很成熟，但這些大膽的嘗試對擴展該方法的應用領域、簡便有效地提高作物的遺傳轉化效率奠定了一定的基礎。

1.3 花粉管通道法

花粉管通道法是一種建立在不依賴于植物細胞組織培養的轉化系統，是周光宇等[11]在20世紀80年代建立的。該技術利用開花植物授粉后形成花粉管通道，使得外源DNA能沿著花粉管滲入，經過珠心通道進入胚囊，直接將外源DNA導入尚不具備正常細胞壁的卵、合子或早期胚胎細胞中，從而實現目的基因的轉移。該方法可用于任何開花植物。據操作方式的不同，它通常有2種方法，即子房注射法和柱頭滴注法。

子房注射法是指使用顯微注射儀把外源DNA溶液注入到子房中，由于子房產生的高壓力及卵細胞的吸收，使外源基因進入受精的卵細胞。劉博林等[12]采用合子期子房微注射法，將龍葵Atrazine抗性基因psbA導入對Atrazine敏感的大豆葉綠體基因組中，經直接用Atrazine涂抹葉片及葉片在較強光誘導下熒光動力學研究和間接分子雜交試驗等檢測方法鑒定，獲得了轉基因大豆植株。張國棟等[13]將玉米自交系和大豆品種東農36的DNA分別導入另一大豆品種中，其后代的突變率分別為10%和5.32%，出現了種子蛋白含量、株高、莖粗、結莢習性、倒伏性、每株分枝數與莢數、粒數與百粒質量等性狀變異。余桂榮等[14]選擇開花后0.5～2.0 h的小麥作受體進行轉化，獲得較高的結實率和轉化率。李余良等[15]用子房注射法將Bt抗蟲基因導入超甜玉米品種粵甜3號，獲得了1株整合有Bt基因的轉基因植株，轉化率為9.09%。李遠新等[16]以黃瓜品種津研4號為受體，以質粒pBI121為供體，建立起高效的黃瓜子房注射轉化系統，試驗表明，黃瓜授粉后12 h注入外源基因的轉化率最高。魏愛民等[17]也用子房注射法得到抗蟲轉基因苗。田間子房注射轉化法主要用于子房較大的作物，如棉花、玉米、瓜類。由于該方法轉化偶然性比較大，因此，成功的關鍵是注射時間及注射位置和深度的把握。

柱頭滴注法是先將正在大量授粉的花柱柱頭切去，然后滴入DNA（DNA的濃度要大于子房注射法）。周春江等[18]利用柱頭滴注法將兔防御素NP-1基因導入小麥中，經田間抗病蟲鑒定，這些植株對于白粉病、葉銹病和條銹病有較強的免疫力和抗性。王永芳等[19]采用柱頭滴注法將谷子的抗逆相關基因DNAj轉入小麥中，獲得了成功，為創造抗逆性改良的小麥新材料奠定了基礎。在大豆方面，雷勃鈞等[20]將半野生大豆的總DNA導入到栽培大豆中，育成我國第1個利用花粉管通道法獲得的大豆品種黑生101。2006年，劉德璞等[21]以吉林20號、吉林30號、吉林45號為供試材料，通過花粉管通道法，將雪花蓮凝集素GNA基因進行轉化，通過接蚜鑒定和PCR檢測，從中篩選出轉基因植株，后代分離符合孟德爾規律，轉化率約為1%。劉建鳳[22]在花粉管通道法的基礎上建立并優化了大豆柱頭滴注法。其具體做法為：選取大豆自花授粉6～8 h后的完全開放的花朵，首先用鑷子去除同一節上不符合要求的花，然后將符合要求的花用鑷子夾去花瓣，接著用剪刀完全剪去花柱，將6 μL轉化溶液滴加在子房傷口處，如氣溫較高，補滴1次，轉化率可達3.18%。趙寶存等[23]在小麥授粉后2～4 h，用剪刀剪去柱頭的1/3，將T型細胞質雄性不育保持系75-23369B線粒體的基因文庫的不同重組子DNA滴在斷面上。結果顯示，重組子ME252和ME317的轉化后代變成可育。張森燕等[24]將構建好的ZmPti1基因的正義表達載體和RNAi載體，通過柱頭滴注法分別轉化到玉米自交系178中。經檢測分別得到15株和18株轉基因植株。此法適用于較小花器的作物。

實際操作中，作物所采用的轉化方式，注入DNA溶液的量均根據子房的大小而定。除了應考慮導入方式對花器（子房、柱頭）傷害最小外，導入時間和時期的選擇也至關重要。對于有些植物開花授粉時間不易控制的，可以先進行人工授粉，再在一定的時間梯度內進行轉化處理。

1.4 胚性組織浸染轉化法

近年來發展起來一種浸染轉化法，不同的研究單位方法不同。其原理是根據種子的發芽生理，將外源DNA隨著種子或幼胚的萌發或生長，進入種胚細胞，在當代就能表現出變異，并得到遺傳。

Rohini等[25]將種子中的一個子葉去掉，把帶有胚軸的另一片子葉萌發后用無菌針在胚軸處輕輕劃幾下，在農桿菌中浸泡幾分鐘，然后共培養、漂洗，子葉繼續萌發、生苗，收獲種子進行轉基因后代的檢測。Rohini等[26]用該方法在花生上獲得成功，轉化效率達3.3%～5.3%。王成杰[27]初步建立了利用農桿菌轉化小麥萌芽種子的方法，并證明外源基因已轉移到植物細胞中。山西省農科院孫毅等發明了以萌動胚為受體的轉化方法，梁雪蓮等[28]用此方法與花粉介導、子房注射法在玉米上轉化bar基因，從轉化率與操作簡便程度上進行比較，認為花粉介導優于萌動種胚法，且二者又優于子房注射法。王昌濤等[29]成功地建立了一個農桿菌介導玉米萌動胚遺傳轉化新體系，具體做法為：把劃好的玉米萌動胚放入YEB液體培養基中，28℃，220 r/min振蕩24 h，然后把種子放在MS固體培養基上共培養3 d，再轉入帶有潮霉素的篩選培養基中7～10 d，經過篩選后的幼苗移栽到溫室中。

胚性組織浸染轉化法克服了組織培養再生難、轉化率低的缺點，不需要高昂的儀器設備，是高頻、簡單、快捷的非組培遺傳轉化途徑，便于一般科研院所推廣應用。但該技術還需要在實踐中不斷完善。

2 問題及展望

本文所述的植物非組培轉化方法具有簡便、快捷、無需組培等優點，但這些方法有的還處于嘗試階段，在作物上應用還不成熟，轉化效率還很低，不能滿足作物育種和功能基因研究的需要。因此，對非組培轉化受體系統的優化和轉化過程中的影響因素仍需進一步研究。目前，花粉管通道法相對成熟，且易于實現大規模基因轉化，是一種很有潛力的作物遺傳轉化方法。目前，花粉管通道法在我國已成為與農作物育種應用結合最為密切的技術，是安全高效的分子育種途徑，是生物技術育種中的一個重要研究領域。

隨著分子生物學和植物基因工程的不斷發展，以轉基因技術為手段的植物遺傳改良成為農業生物技術育種的重要途徑。而轉基因作物的安全性越來越受到人們的重視，其中，篩選標記基因和載體骨架序列是影響轉基因作物安全性評價的重要因素。基因槍和農桿菌轉化法目前均較難實現無載體骨架序列無選擇標記基因的轉化，而花粉管通道法等非組培方法可以解決該問題。因此，隨著非組培轉化方法的改進、轉化效率的提高，植物非組培轉化方法將為作物分子育種和基因功能研究提供有力的方法保障。

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