化感物質的提取、分離及鑒定方法的研究

陳紹莉 周寶利

（遼寧省果蠶管理總站 110034）（沈陽農業大學園藝學院）

化感作用屬于化學生態學的研究范疇，是一門新興學科。化感作用的英文為 “Allelopathy”，源于希臘語“Allelon（相互）”和“Pathos（損害、妨礙）”。1937年Molish首先將其定義為：某種植物（包括微生物）生成的化學物質對其他植物產生某種作用的現象。隨著科學研究的迅速發展，對化感作用的認識也在不斷深入和全面。1984年Rice在《Allelopathy》第二版中將其較完整地定義為：植物或微生物的代謝分泌物對環境中其他植物或微生物的有利或不利的作用。化感作用在生態系統中普遍存在，并通過化感物質對受體起化感作用。因此，對化感物質的認識及研究十分重要，其中，提取、分離和檢測化感物質是正確、全面認識化感現象的前提。

1 化感物質的種類

迄今為止所發現的化感物質主要有：水溶性有機酸、直鏈醇、脂肪族醛和酮、簡單不飽和內酯、長鏈脂肪酸和多炔、醌類、簡單酚、苯甲酸及其衍生物、肉桂酸及其衍生物、香豆素類、類黃酮、單寧、內萜和甾類化合物、氨基酸和多肽、生物堿和氰醇、硫化物和芥子油苷、嘌呤和核苷等。其中，最常見的是低分子量有機酸、酚類和內萜類化合物。

2 化感物質的提取方法

化感物質可以通過浸析、揮發、植物殘體分解和根系分泌等方式進入環境中。根據化感物質的作用途徑，通常分別采用夾層法、常溫吸附法、浸提法或腐解法和疏水性根滲出液連續收集法（CRETS）等方法提取。化感物質的復雜性，使得化感物質的提取收集比較困難。

目前，人們最常用的是浸提法收集化感物質。浸提劑主要是兩類化合物：一是無機化合物，如：H2O、NaOH、Na4P2O7等；二為有機化合物，如：甲醇、石油醚、氯仿、二氯甲烷、丙酮、乙醚、乙酸乙酯、乙醇等等。土壤中的化感物質主要是以游離態和可逆束縛態的形式存在于土壤溶液中，選用NaOH和Na4P2O7作為浸提劑可將植物殘體和土壤有機質中的酚酸類物質提出；有機溶劑（如：氯仿）能夠直接從枯枝落葉、土壤腐殖酸和微生物膜中提取出化合物，但是，使用有機溶劑提取出來的化感物質與自然條件下所產生的在質和量上均有所區別。所以，選擇浸提劑時應全面、慎重地考慮，以便使檢測結果更加真實可靠。

在浸提過程中，一般采用往復式振蕩和索式提取的方法進行，然而這些方法在處理樣品時，浸提時間較長并且浸提不完全，樣品容易損失。另外，還可以采用超聲波方法浸提，由于超聲波深層的超聲破碎作用，從理論上說能夠省時，并且浸提更加完全，但實際操作條件還有待于進一步的研究。

Tang和Young提出的連續抽提系統比溶劑提取方法更有效，并有助于從未擾動的根際中分離和鑒定化感物質。最近，劉秀芬等在減壓條件下，用帶有多孔陶頭的塑料管原位收集土壤溶液，并成功地鑒定出了以前未見報道的化感物質對二叔丁基苯甲酸，其對玉米和小麥生長發育的抑制作用明顯強于同濃度的常見化感物質苯甲醛和阿魏酸。另外，同位素示蹤技術的應用使得在自然環境中進行根系分泌物的研究成為可能。Meharg等用14CO2標記黑麥草，在溫室中成功地進行了土壤微生物作用下根分泌物的研究。有時，為了強調防止某些化感物質被氧化，必須在充滿氮氣條件下進行提取。

3 化感物質的分離和純化

提取得到的混合物必需經過純化才能進行儀器檢測。常見的純化方法有：萃取法、樹脂法和層析法。

3.1 萃取法

根據化感物質在兩個不相溶或部分互溶的溶劑中的分配度（溶解度）不同，從而達到分離純化的目的。此法雖操作繁瑣，不夠精確，但由于所用器械簡單方便，快速易行，現在仍被廣泛使用。由于化感物質在常用有機溶劑（如：乙醚、乙酸乙酯和二氯甲烷等）中的溶解狀況不同，可以使用不同有機溶劑反復萃取將含有的化感物質全部提出來。

3.2 樹脂法

這是近年來發展起來的一種新方法，根據分離機理不同，分為交換法和吸附法。交換法是利用陽離子和陰離子樹脂，吸附陰陽離子，無極性或極性較弱的有機分子通過，然后洗脫和提取目標組分，從而達到純化的目的；吸附法則是使用吸附樹脂 （如：XAD-24、XAD-22或GDX-2102樹脂以及硅膠等）吸附和富集含化感物質在內的一些有機化合物，達到分離和純化的目的。

3.3 層析法

一般常用紙層析和柱層析法分離和純化化感物質。自從Rulen在本世紀中葉提出用柱層析測定植物組織中的有機酸后，層析法便被廣泛地用于土壤中化感物質之一的有機酸的研究。但柱層析法手續繁復，且時間長；而紙層析和薄板層析法雖操作簡便，但不夠精確，所以它們現在基本上已不作為檢測手段了。

4 化感物質的鑒定

化感物質多數為次生代謝產物，數量甚微，而且有的易揮發或在空氣中易發生化學反應，因而，其檢測方法在很大程度上依賴于科學技術的進步。近年來，近代實驗物理方法在化學分析上的應用給新發現的化感物質結構的測定帶來了比較簡單而準確的方法。根據測定熔點、紅外光譜、紫外光譜、質譜和核磁共振譜等參數來判斷其中存在的功能團、共軛體系、該未知物質的分子量和結構以及H原子和C原子在分子中的結合方式等信息，確定其化學結構，最后根據測定的結構用已知的標樣或合成的標樣來鑒定化感物質的含量。

伴隨著科學技術的不斷發展和現代化儀器設備的更新換代，特別是電腦分析控制程序的普遍應用，利用氣相色譜（GC）技術、高效液相色譜（HPLC）技術和氣相-質譜聯用（GC-MS）技術研究化感物質獲得了很大的發展。其中，可由GC分析的物質，其沸點在500℃以下，分子量要小于450，而熱穩定性差、易于分解、變質以及具有生理活性的物質，不適合使用GC檢測，GC所分析的物質占有機物總數的15%～20%；HPLC的使用范圍較廣，可檢測的物質占有機物總數的80%～85%，但在HPLC廣泛應用的同時，GC仍然發揮著重要作用。把色譜儀的分離裝置作為質譜儀的進樣系統，把質譜儀作為色譜儀的檢測系統，即把色譜儀的高分辨率和質譜儀的高鑒別能力結合起來，組成GC-MS或液相-質譜聯用（LC-MS）儀器，是目前解決復雜未知物定性問題的最有效工具之一。

植物化感作用機理及應用的研究，已成為當今的熱點之一。為了更好的研究化感作用，研究的方法也要不斷進行完善和探索，逐步建立一套操作簡潔、檢測快速、批量篩選、針對性強和檢測結果可比性好的體系，加速其在農業生產實踐中的應用。