抗菌肽分子設計研究進展

宋雪瑩，馮興軍，李 靜

（東北農業大學動物營養研究所，哈爾濱150030）

抗菌肽在自然界中分布廣泛，種類繁多，已相繼從細菌、真菌、兩棲類、高等植物、哺乳動物以及人類中發現并分離獲得[1-2]。與普通抗生素相比，抗菌肽的抗菌譜廣，相對分子質量小，熱穩定性好，無免疫原性，不易產生耐藥性，對真核細胞幾乎沒有作用，只對原核細胞和發生病變的真核細胞有作用，但活性不夠理想，成為影響抗菌肽應用的限制因素之一。研究抗菌肽構效關系，通過分子設計與改造進一步提高抗菌肽的活性成為目前該領域的研究熱點。本文綜述了近年來抗菌肽分子設計的最新進展與成果，為相關領域的研究提供理論依據。

1 抗菌肽分子設計的主要原則

抗菌肽作為一種多肽序列，由氨基酸組成，生物學活性與多肽分子的多種結構參數密切相關，包括多肽分子的等電點、靜電荷、疏水性、親水性、二硫鍵及其氨基酸序列、α-螺旋等參數。

1.1 含有α-螺旋結構的線性抗菌肽

目前大部分抗菌肽的結構功能研究以及分子設計主要集中于兩親α-螺旋抗菌肽。α-螺旋抗菌肽分布最廣，數量最多，并具有廣譜抗性；該類抗菌肽長度短，易于化學合成；線性結構簡單，易于通過圓二色譜分析和多維核磁共振進行結構測定[3]。

α-螺旋在抗菌肽發揮抗菌作用的過程中具有重要作用。α螺旋是破壞、裂解細菌的主要結構，當抗菌肽結合到細菌細胞膜上時，α螺旋相互聚集使細胞膜形成孔洞，細胞質外溢而致細菌死亡[4-6]。經1H NMR分析表明，當用Ala替換抗菌肽分子中的Pro殘基后，其二級結構由伸展狀轉變成為螺旋狀，導致其膜插入程度的增加和跨膜遷移能力的提高，更容易進入細胞質及胞質靶位點[7]。

有研究認為，N-端的α-螺旋結構域很重要，足以維持抗菌活性[8]。目前仍未研究出抗菌肽螺旋度與抗菌活性的定量關系。主要原因是由于抗菌肽的活性受多種因素決定。氨基酸替換除改變螺旋度外，同時也導致其他結構參數的改變，如疏水力矩、疏水性、極性和非極性結構域的大小以及電荷數和電荷分布等[9-10]。

1.2 特殊殘基對抗菌活性的影響

在抗菌肽天然結構中有部分氨基酸被另一種氨基酸取代，可改變抗菌肽的殺菌能力。在保留兩親螺旋結構的前提下進行單殘基突變，用甘氨酸取代抗菌肽Ovispirin-1第10位的異亮氨酸，結果克服了對紅細胞的溶血性，并提高了抗菌活性[11]。人工合成了[A6]-IsCT多肽，與天然抗菌肽IsCT相比，第6個氨基酸殘基Trp被Ala所替換。被替換后的[A6]-IsCT幾乎無抗菌活性[12]。類似的研究發現，用Leu取代Pro可使人工合成的抗菌肽P18的活性下降 2 倍[13]。

1.3 抗菌肽的陽離子性

抗菌肽的陽離子性與抗菌肽的抗菌機制有關，由于細胞膜外帶有負電荷，所以呈陽離子性的抗菌肽易與其結合并通過細胞膜，從而使病原細胞瓦解。此外，在不同的pH下，氨基酸帶有不同的電荷，如在中性或偏酸性條件下，Lys和Arg都帶正電荷，所以含Lys和Arg受pH變化影響較小；富含His的抗菌肽受pH變化影響較大[14]。因此增加帶正電氨基酸的數量，或改變其在肽鏈中的位置，均可影響抗菌肽的二級結構，從而進一步影響其抗菌活性。

1.4 抗菌肽C端酰胺化和N端無多余的殘基對抗菌活性的影響

抗菌肽C端酰胺化和N端無多余的殘基都將增加抗菌肽的抗菌活性。由于C端酰胺化可引起多肽靜電荷的增加，使得進入靶細胞的能力增加，抗菌能力加強。N端插入細胞膜是抗菌肽殺死細胞的必需條件，N端含有多余的殘基將增加N端的柔韌性和擺動性，若破壞兩親結構的形成和穩定，造成N端難以插入細胞膜，將導致活性降低。對人工合成的抗菌肽P18逐一去除N-端和C-端氨基酸殘基，發現隨著末端殘基的去除，其抗菌活性成倍下降。

1.5 抗菌肽的親水性和疏水性

抗菌肽活性是親水基團和疏水基團相互作用的結果。疏水作用對其活性的影響是通過改變肽鏈中Leu、Ile、Val數量實現的。增加疏水性氨基酸能夠增加抗菌肽形成兩性α-螺旋的能力，而α-螺旋的增加也提高了抗菌肽的穩定性。但是增加分子的疏水性，抗菌肽的抗菌活力和對哺乳類動物細胞的溶血活性同時增加，這是由于疏水基團在抗菌肽插入細胞膜的過程中起關鍵作用。肽鏈疏水面的正電荷可能對抗菌肽的溶血活性有重要影響。研究發現，Melittin抗菌活性和溶血性隨著疏水力矩降低而減弱，直至消失[15]。也有報道，平均疏水力矩的變化比疏水性和螺旋度的變化對抗菌活性的影響更大[16]。

2 抗菌肽分子設計的方法

2.1 以天然抗菌肽為模板設計合成類似物

根據天然抗菌肽，以其為設計模板，在一個或多個序列位置上氨基酸殘基發生改變，或改變肽鏈長度，設計合成新的抗菌肽。該方法涉及到在活性中起重要作用的氨基酸殘基或結構域。利用這種方法獲得許多的類似物已被設計合成并用于抗菌肽構效關系研究。

2.2 雜合肽的設計

根據GenBank中公布的牛抗菌肽bac7和bac5成熟肽基因序列，串聯后人工合成了融合基因Bac7-Bac5片段，克隆于原核表達載體pET32中，構建了重組表達載體pET-B7-B5，將其轉化于E.coliBL21中，實現了重組蛋白B7-B5（rB7-B5）的過表達，B7-B5表達量約占細菌總蛋白的36.6%，對豬胸膜肺炎放線桿菌和耐藥性大腸桿菌具有很好的抑菌活性[17]。將 cecropinA（1-8）和 magainin2（1-12）串聯起來，構建至含有人泛素融合蛋白 pQE30重組表達質粒上，在大腸桿菌M15中得到了高效異源表達[18]。

2.3 氨基酸殘基替換

改變抗菌肽的某個氨基酸殘基可影響抗菌肽的活性，且該方法在克服抗菌肽毒性問題上有理想的效果。在研究LfcinB時，進行單殘基突變，用丙氨酸取代抗菌肽LfcinB第6位和第8位的色氨酸，結果發現其中任何一個色氨酸被取代，都會造成抗菌肽失去抗菌活性[19]。

2.4 截取天然抗菌肽的部分序列

人工合成的多肽MCF，由Melittin的C端15個氨基酸殘基組成，MCF包含了Melittin的大部分兩親片段，抗菌活性比Melittin高5~7倍，而溶血活性低300倍。MCF的類似物MCFA是兩個陽離子殘基從C端轉到N端形成的，與Melittin的抗菌活性相當，但溶血活性僅比MCF高一點。說明抗菌肽的生物物理學特性與其生物學活性密切相關[20]。

3 抗菌肽分子設計的主要步驟

選擇天然活性相對較高的作為母本抗菌肽，結合結構參數，進行分子設計，設計系列抗菌肽分子衍生物；通過多肽分析軟件對設計抗菌肽分子衍生物分析，對其進行優化；通過軟件分析優化后，選出結構參數理想、具有高活性潛力的新型抗菌肽分子，對其進行化學合成；檢測化學合成抗菌肽的活性，進一步驗證篩選；測定篩選的具有理想活性的新型抗菌肽結構，探討抗菌肽結構與活性的關系，在獲得新型抗菌肽的同時，進一步完善抗菌肽構效關系和分子設計的理論基礎。

4 展望

抗菌肽具有很多優點，但依然存在一定問題。抗菌肽較其他抗菌藥物相比活性較低，所以通過改變抗菌肽結構的方式提高活性。但有時在提高抗菌活性的同時也一定程度的提高了細胞溶血性。綜合利用改變抗菌肽活性參數，設計需高活性，低溶血性的抗菌肽仍是需要繼續研究的問題。

[1] He J,Anderson M,ShiW,et al.Design and activity of a dualtargeted antimicrobial peptide[J].International Journal of Antimicrobial Agents,2009,33（6）:532-537.

[2] Urban E,Nagy E,Pal T,et al.Activities of four frog skin-derived antimicrobial peptides(temporin-1DRa,temporin-1Va and themelittin-related peptides AR-23 and RV-23)against anaerobic bacteria[J].International Journal of Antimicrobial Agents,2007,29（3）:317-321.

[3] Giangaspero A,Sandri L,Tossi A.Amphipathic alpha helical an timicrobial peptides[J].Eur J Biochem,2001,268(21):5 589-5 600.

[4] 張宗梁,姚鑫.Toll受體介導的天然免疫信號傳遞系統:從果蠅到人類[J].上海免疫學雜志,1998,18（6）:321-324.

[5] Bals R.Epithelial antimicrobial peptides in host defense against infection[J].Respir Res,2000,1(3):141-150.

[6] Lemaitre B,Reichhart JM,Hoffmann JA.Drosophila host defense:Differential induction of antimicrobial peptide genes after infection by various classes ofmicroorganisms[J].Proc Natl Acad Sci USA,1997,94(26):14 614-14 619.

[7] Zhang L J,Rozek A,Hancock R EW.Interaction of cationic antimicrobial peptides with model membranes[J].J Biol Chem,2001,276（8）:35 714-35 722.

[8] Mor A,Nicolas P.The NH2-terminalalpha-helicaldomain 1-18 of dermaseptin is responsible for antimicrobial activity[J].J Biol Chem,1994,269（3）:1 934-1 939.

[9] Dathe M,Wieprecht T.Structural features of helical antimicrobial pep tides:their potential tomodulate activity on modelmem branes and biological cells[J].Biochimicaet Biophysica Acta,1999,1 462（1-2）:71-87.

[10] Wieprechta T,Dathea M,Nikolenkoa H,et al.Hydrophobicity,hydrophobic moment and angle subtended by charged residues modulate antibacterial and haemolytic activity of amphipathic helical peptides[J].FEBS Lett,1997,403（2）:208-212.

[11] Sawai M V,Waring A J,Kearney W R,et al.Impact of single residuemutations on the structure and function of ovi spirin pnovispirin antimicrobial peptides[J].Protein Eng,2002,15（3）:225-232.

[12] Lee K,Shin SY,Kim K,et al.Antibiotic activity and structural analysis of the scorpion-derived antimicrobial peptide IsCT and its analogs[J].Bioche Biophy Res Comm,2004,323（2）:712-719.

[13] Shin S Y,Kang SW,Lee D G,et al.CRAMP analogues having potentantibiotic activity againstbacterial,fungal,and tumor cells without hemolytic activity[J].Biochem Biophys Res Commun,2000,275:904-909.

[14] Chan D I,Prenner E J,Vogel H J.Tryptophan and arginine-rich antimicrobial peptides:Structures and mechanisms of action[J].Biochim Biophy′s Acta,2006,1 758（9）:1 184-1 202.

[15] Pathak N,Salas-Auvert R,Ruche G,et al.Comparison of the effects of hydrophobicity,amphiphilicity,and alpha-helicity on the activities of antimicrobial peptides[J].Proteins,1995,22（2）:182-186.

[16] Perez-Paya E,Houghten R A,Blondelle SE.The role of amphipathicity in the folding,self-association and biological activity of multiple subunit smallproteins[J].J Biol Chem,1995,270（3）:1 048-1 056.

[17] 趙昆,劉思國,王春來,等.牛抗菌肽Bac7-Bac5融合基因在大腸桿菌中的過表達、純化及抑茵活性[J].中國生物工程雜志,2007,27（3）:65-70.

[18] Xu X,Jin F,Yu X,et al.High-level expression of the recombinant hybrid peptide cecropinA（1-8）-magainin2（1-12） with an ubiquitin fusion partner in Escherichia coli[J].Protein Expression and Purification,2007,55（1）:175-182.

[19] 李桂平,陳儀本.一種新融合抗菌肽Hex-Mag基因的克隆表達及其抗菌活性的研究[J].微生物學報,2007,47（1）:115-120.

[20] Subbalakshmi C,Nagaraj R,Sitaram N.Biological activities of C-terminal 15-residue synthetic fragment of melittin:design of an analog with improved antibacterial activity[J].FEBS Lett,1999,448（1）:62-66.