飼料中霉菌毒素的微生物脫毒研究進展

趙必遷，周安國

（1.四川農業大學動物營養研究所，教育部抗病營養研究中心，四川 雅安 625014；2.攀枝花市行遠牧業有限公司，四川 攀枝花 617061）

霉菌毒素是一類差異巨大的小分子量化合物，由微生物經過次生代謝過程產生，對飼料的污染十分常見。據估計，目前已有約100 000種霉菌被鑒定，其中約400種對動物具有潛在的毒性，這些具有潛在毒性的霉菌中約5%可以產生有毒物質。年均氣溫較高的國家和地區這一問題尤其嚴重，而中國正處于亞熱帶地區，各地區的種植水平差異很大，飼料原料貯運條件參差不齊，因此由霉菌毒素導致的動物急性、慢性中毒較為常見。

1 霉菌毒素的危害

霉菌是一種多細胞微生物，可通過種子或孢子兩種形式繁衍后代，條件不適宜時往往由孢子形式繁衍。霉菌毒素由中溫霉菌產生，相對細菌而言，霉菌對濕度、pH的要求較低。當霉菌處于干燥、低溫或處于與其他霉菌競爭的應激情況時，會產生霉菌毒素。由于霉菌生長有一定的地域性，導致不同區域占優勢的霉菌毒素種類不同。飼料中常見的產毒素霉菌主要有曲霉屬（aspergillus）、青霉屬（penicillium）、鐮孢菌屬（fusatium）和麥角菌屬（claviceps）等。各種霉菌可以產生多達數百種霉菌毒素，常見的霉菌毒素有：黃曲霉毒素（aflatoxins）、赭曲霉毒素A（ochratoxin A）、單端孢霉烯族毒素（trichothecenes）、玉米赤霉烯酮（zearalenone）、伏馬菌素（fumonisins）等[1]。

霉菌毒素可以對動物引起一系列嚴重的生理和生物毒害，如致癌性（黃曲霉毒素、褚曲霉毒素和伏馬霉素）、致突變性（黃曲霉毒素和柄曲霉毒素）、致畸胎性（褚曲霉毒素）、致雌激素異常（玉米赤霉烯酮）、致出血（單端孢霉烯）、免疫毒性（黃曲霉毒素和褚曲霉毒素）、腎毒性（褚曲霉毒素）、肝毒性（黃曲霉毒素）、皮膚毒性（單端孢霉烯）及神經毒性（麥角堿）等，另外還有些具有細胞毒性[2]。

2 霉菌毒素的微生物脫毒

微生物脫毒法是利用一些特定的微生物或其產生的酶來降解霉變飼料中的霉菌毒素，將這些微生物加入飼料中，實現霉菌毒素的溫和降解，避免高溫、強酸、強堿等易破壞營養成分的環境和條件，達到去除霉菌毒素的目的，此過程中，無需帶入有毒有害的化學物質，同時還盡可能地減少了飼料中營養物質的損失[3]。

2.1 酵母發酵去除霉菌毒素

酵母發酵過程去除谷物中的霉菌毒素的方法研究較早并得到了一定的效果。一些微生物（包括酵母、霉菌及細菌）可將玉米赤霉烯酮轉化為α-玉米赤霉烯醇及β-玉米赤霉烯醇，但這種轉化尚不能被認為是一種脫毒過程，因為兩者都具有生殖毒性。棒曲霉毒素可被數種酵母菌降解，Moss等對釀酒酵母分解棒曲霉毒素的終產物進行了研究，結果表明棒曲霉毒素已喪失[4]。F2毒素污染的糧食可作為假絲酵母發酵的底物，發酵后毒素幾乎全部留在發酵液中，其活性降低了10倍[5]。Janos等將 3種不同酵母菌株放在1個容器中同時添加赭曲毒素A、煙曲霉毒素B1和B2進行發酵8 d后，赭曲毒素A、煙曲霉毒素B1和B2分別減少了13%和28%、17%[6]。

2.2 非產毒霉菌發酵去除霉菌毒素

Park等在研究一種韓國發酵豆制品時發現，這種豆制品的天然發酵過程中有約20種不同的霉菌參與，其中米曲霉、青霉、毛霉和根霉是其中的優勢真菌，在發酵的前3~4周（塊狀發酵階段），發酵制品中的黃曲霉毒素B1及G1明顯增加；在其后進行的鹽水浸泡發酵階段，黃曲霉毒素則被迅速降解。鹽水浸泡發酵階段2個月后，黃曲霉毒素的量已經降至最初毒素量的10%～20%，而第 3個月時黃曲霉毒素幾乎被完全降解，研究表明，在天然發酵食品的制備過程中，存在著有效的降解霉菌毒素的微生物或生化過程[7]。Varga等共對70株曲霉進行了研究，發現有一株A.japonicus和兩株A.niger可以降解或部分降解赭曲霉毒素A，在對 A.niger CBS120.49株的研究中發現，其在液體培養基中分解OA較慢，OA可以在7 d內全部轉化為毒性較低的化合物赭曲霉毒素A，赭曲霉毒素A的量在發酵前6 d逐漸增加，但在隨后的10 d培養中被進一步降解至痕量。而在固體培養基中，OA的降解速度要快得多，OA含量可在2 d內降解到初含量的20%以下，而5 d內OA就可全部轉化為赭曲霉毒素α。Varga等對根霉屬（Rhizopus）不同種的55個菌株進行了研究，發現有不少根霉菌株可分解赫曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和棒曲霉毒素[8]。其中可以降解赭曲霉毒素的 R.stolonifer,R.microsporus,R.homothallicus,R.oryzae以及4株未鑒定到種的根霉株系，其中有一根霉株系可以在16 d內將赭曲霉毒素A降解95%以上；一株R.stolonifer則可有效地降解潮濕小麥中的赭曲霉毒素A[9]。

2.3 細菌降解霉菌毒素

據報道，綿羊、牛等反芻動物瘤胃內容物的細菌能分解某些真菌毒素。為了獲得能降解赭曲毒素A的微生物，Fuchs等對37種細菌、10株酵母和12種霉菌進行了篩選，發現醋酸鈣不動桿菌在25和30℃條件下，均能將初始質量濃度為10 ng·L－1的赭曲毒素A分解，其終產物比赭曲毒素A對雞胚的毒性低了很多。腸道中的微生物菌群可以通過酶促降解環氧環從而對嘔吐毒素（DON）起減毒作用，Fuchs等從牛瘤胃的富集培養物中分離到1株可以在24～48 h內轉化 DON和其他單端孢霉烯族毒素的厭氧優桿菌屬細菌，從而部分地減輕毒素的毒力[10]。Volkl等發現一種可以把 DON轉變成3-酮基-DON的混合微生物培養物餅[11]。

Line等對黃桿菌屬的Flavobacterium aurantiacum降解黃曲霉毒素B1的機理進行了研究，結果表明，有活性的黃桿菌細胞可以快速地將黃曲霉毒素B1（可溶于氯仿）轉化為水溶性的化合物。試驗6 h后，活細胞試驗組結果只有24.1%的放射性保留在氯仿層中；而無細胞的空白試驗組則不會產生任何水溶性化合物（即放射性全部保留在氯仿層中）；滅活的黃桿菌細胞對照組則有99.7%的放射性保留在氯仿層中，且不產生水溶性的化合物。這一結果表明，活的和死的黃桿菌細胞均可去除毒素[12]。

Nagendra等研究了4株雙歧桿菌和2株乳桿菌吸附黃曲霉毒素B1的能力，將乳酸菌與黃曲霉毒素 B1在37℃混合振動15、60和120min后，檢測其中的黃曲霉毒素 B1，結果表明，乳酸菌對黃曲霉毒素B1去除能力為20%～50%，用蒸餾水洗滌兩遍吸附黃曲霉毒素B1的乳酸菌后，有10%～40%的黃曲霉毒素B1還被吸附在乳酸菌上，說明乳酸菌對黃曲霉毒素B1有較強的吸附作用[13]。E1-Nezami等篩選出了兩株鼠李糖乳桿菌ATCC53103和鼠李糖乳桿菌DSM-705，兩株菌吸附黃曲霉毒素B1的能力高達80%；吸附著黃曲霉毒素B1的乳酸菌細胞經乙醇、紫外線照射、超聲或堿處理后死菌對黃曲霉毒素B1的吸附強度不受影響[14]。李志剛等研究結果證實，乳酸菌-黃曲霉素復合體無論是在益生菌活菌狀態，還是死菌狀態，與自由黃曲霉毒素的回復突變無顯著差異，故益生素吸附黃曲霉素能力取決于細胞壁結構，且革蘭氏陽性菌吸附能力優于革蘭氏陰性菌[15]。

3 微生物去除霉菌毒素機理

3.1 微生物對霉菌毒素的吸附作用

有研究表明，酵母對霉菌毒素的影響可能與酵母細胞壁表面的葡甘聚糖有關。酵母或酵母細胞壁成分可作為霉菌毒素吸附劑使用。酵母細胞壁對毒素的吸附能力明顯強于酵母的全成分，這說明酵母細胞壁的特殊結構對霉菌毒素產生吸附力。酵母細胞壁分3層，外層為甘露寡糖和蛋白復合物，中間層為葡聚糖，內層為幾丁質，細胞壁上有多糖、蛋白質和脂類，這些物質對毒素的吸附是通過氫鍵、離子鍵和疏水作用力等實現的。酵母細胞壁提取物是以釀酒酵母為原料，經過細胞破壁、酶解、分離提純和干燥等工藝精制而成。蘇軍等研究將鐮刀菌毒素自然污染的玉米以 25%和50%的比例等量替換基礎飼糧中的正常玉米，并在此基礎上加或不加葡甘露聚糖（EGM）霉菌毒素吸附劑觀察其對斷奶仔豬生產性能、養分利用率的影響。結果表明，飼喂被鐮刀菌毒素污染的飼糧降低了仔豬的生產性能，且隨霉變玉米替代比例增加，采食量和日增重降低程度增加，顯著或極顯著降低了仔豬飼糧中有機物質、蛋白質、鈣、磷的表觀消化率和蛋白質生物學價值，25%污染的玉米飼糧對鈣的表觀消化率無影響，在被鐮刀菌毒素污染飼糧中添加EGM 0.2%吸附劑可使上述不良效應得到改善，尤以在25%污染玉米飼糧中添加EGM吸附劑0.2%可獲得顯著的保護效應[16]。因此，酵母細胞壁解毒的機理可能是葡甘露聚糖捕獲黃曲霉毒素，從而阻止了胃腸道對毒素的吸收，達到解毒的效果。

近年來，研究認為黃曲霉毒素B1是以乳酸菌-黃曲霉素復合體形式存在。Haskard等研究表明，氫鍵在乳酸菌-黃曲霉素復合體中不起作用，疏水相互作用是維持結構的最主要作用[17]。Bolognani等研究認為形成的乳酸菌-黃曲霉素復合體后，黃曲霉素化學結構沒變化，并具有較強的毒性[18]。李志剛等采用Ames試驗檢測被吸附的黃曲霉毒素B1的致突變性，乳酸菌-黃曲霉素復合體與自由黃曲霉毒素的回復突變無顯著差異[15]。盡管如此，形成的乳酸菌-黃曲霉素復合物仍可阻止黃曲霉素在動物體吸收，同時復合物較黃曲霉更容易排出體外，減少黃曲霉素對動物機體的危害[19]。

3.2 微生物的酶解作用

在玉米赤霉烯酮的脫毒研究中，Takahashi等發現螺旋聚孢屬中的Clonostachys rosea可將玉米赤霉烯酮轉化為另一種毒性較低的化合物，而其中起作用的是一種水解酶lactonohydrolase[20]。Liu等從Armillariella tabescens菌中分離出一種可以脫除黃曲霉毒素B1毒性的黃曲霉毒素脫毒酶（Afeatoxin detoxifizyme），通過該酶的處理，樣品中黃曲霉毒素的含量明顯減少，黃曲霉毒素特征熒光明顯減弱毒性，說明該酶是通過打開雙呋喃環破壞黃曲霉毒素[21]。目前在這一方面的研究還比較少，但隨著對脫毒微生物研究的深入，越來越多的微生物將被發現與霉菌毒素的脫毒有關，更深入的研究其脫毒機理可能會發現更高效、更易于應用的細菌、酵母、霉菌、酶制劑。

4 展望

當前應用的脫霉劑主要還是以物理吸附為主的無機物。有關微生物的脫霉研究主要集中在酵母及其細胞壁、乳酸菌等益生素類菌體對霉菌毒素的吸附作用，對微生物生物轉化及酶解作用的研究還很少。此后對微生物脫霉研究應深入其生物轉化機理，更進一步的揭示其脫霉過程，研究出更高效的微生物脫霉產品。

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