雞傳染性喉氣管炎的診斷

薛春宜，曹永長(zhǎng)，王林果，畢英佐

（1.中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院有害生物控制與資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510006；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，廣東廣州 510642）

雞傳染性喉氣管炎的診斷

薛春宜1，曹永長(zhǎng)1，王林果2，畢英佐2

（1.中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院有害生物控制與資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510006；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，廣東廣州 510642）

傳染性喉氣管炎病毒(ILTV）是一種能夠引起雞急性上呼吸道感染的皰疹病毒。由它所引起的疾病稱為雞傳染性喉氣管炎。該病毒在分類上屬于皰疹病毒科α亞科，學(xué)名為雞皰疹病毒I型(gallid herpesvirus l ）。1925年，該病首先報(bào)道于美國(guó)，并命名為氣管-喉頭炎，后又稱為傳染性支氣管炎，支氣管肺炎等。1963年Gruiehk shank在電鏡下觀察負(fù)染標(biāo)本，證明本病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)同單純皰疹病毒一致后，才明確了引起ILT的病毒屬于皰疹病毒。2000年，國(guó)際病毒分類委員會(huì)(ICTV）將ILTV從水痘病毒屬劃出，建立一個(gè)新屬：類傳染性喉氣管炎病毒屬，這個(gè)屬唯一的病毒就是ILTV。

ILTV只有一種血清型，在雞上表現(xiàn)不同的毒力。與其它的皰疹病毒不同，ILTV的宿主范圍窄，幾乎只感染雞和雞源細(xì)胞。ILTV可以在雞的呼吸道上皮細(xì)胞迅速?gòu)?fù)制并能在感覺(jué)神經(jīng)元進(jìn)行潛伏感染。感染ILTV的雞呼吸困難、咳嗽、氣喘，引起喉頭氣管黏膜肥厚、腫脹、糜爛和出血。雞群感染此病毒后，發(fā)病率為90%～100%，死亡率為5%～70%(平均20%），可造成大的經(jīng)濟(jì)損失。近年來(lái)，該病己經(jīng)在包括我國(guó)在內(nèi)的世界范圍內(nèi)，特別是養(yǎng)雞業(yè)集中的地區(qū)傳播，已經(jīng)成為養(yǎng)雞業(yè)的重要疫病之一。

在自然條件下，本病主要侵害雞，雖然各種年齡的雞均可感染，但以成年雞的癥狀最為特征。病雞及康復(fù)后的帶毒雞是主要傳染源，經(jīng)上呼吸道及眼分泌物傳染。易感雞群與接種了疫苗的雞作較長(zhǎng)時(shí)間的接觸，也可感染發(fā)病。被呼吸器官及鼻腔排出的分泌物，污染的墊草、飼料、飲水和用具可成為傳播媒介。人及野生動(dòng)物的活動(dòng)也可機(jī)械傳播。種蛋蛋內(nèi)及蛋殼上的病毒不能傳播，因?yàn)楸桓腥镜碾u胚在出殼前均已死亡。本病一年四季都能發(fā)生，但以冬春季節(jié)多見(jiàn)。雞群擁擠，通風(fēng)不良，飼養(yǎng)管理不善，維生素A缺乏，寄生蟲(chóng)感染等，均可促進(jìn)本病的發(fā)生。此病在同群雞傳播速度快，群間傳播速度較慢，常呈地方流行性。本病感染率高，但致死率較低。該病發(fā)病機(jī)制是由于病毒在喉頭和氣管黏膜的上皮細(xì)胞中繁殖，引起這些黏膜的發(fā)炎和一部分上皮細(xì)胞中的嗜酸性核內(nèi)包涵體的形成。由病毒所致的黏膜發(fā)炎，常因兼性病原菌的侵入而惡化，在黏膜上形成纖維蛋白假膜，引起呼吸困難或窒息，病毒只侵入血液中，但并不在血液中繁殖，所以不引起病毒血癥。

該病和多種疾病常常并發(fā)，造成該病診斷比較難。這里介紹診斷該病的幾種方法。

一、初診

臨床上可根據(jù)臨床癥狀和剖檢病變對(duì)該病做出初步診斷。

（一）臨床癥狀病雞伸頸張口吸氣，低頭縮頸呼氣，閉眼呈痛苦狀。多數(shù)雞表現(xiàn)精神不振，食欲下降或拒食，呼吸時(shí)發(fā)生濕性咳嗽，發(fā)出響亮的喘鳴聲，呈下蹲姿勢(shì)?？人詴r(shí)甩頭，甩出血樣痰液。從鼻流出漿液性或膿性粘液，呈半透明狀。有時(shí)眼角存在膿狀物，眼瞼腫脹，甚至封閉整個(gè)眼球。嚴(yán)重病例可見(jiàn)極度呼吸困難，痙攣性咳嗽，咳嗽或搖頭時(shí)咯出帶血的粘液，有的病雞因氣管內(nèi)滲出物不能咳出而窒息死亡。病雞稍瘦，雞冠和肉髯發(fā)紺。有時(shí)排出綠色、黃白色稀便，最后多因衰竭而死亡。若是產(chǎn)蛋雞，其產(chǎn)蛋量迅速下降或停止，產(chǎn)薄皮蛋、無(wú)殼蛋增多。

（二）剖檢病變剖檢病死雞可見(jiàn)氣管和喉頭黏膜明顯充血、出血和肥厚，氣管上皮壞死，出血性氣管炎和喉炎，氣管腔內(nèi)有大量滲出物及凝固似紅綾子樣的血性痰液，有假膜的很容易剝離；鼻黏膜充血、肥厚，腔內(nèi)有大量粘液，喉頭處有干酪樣栓子；有的病雞還伴有結(jié)膜炎變化，常見(jiàn)眼瞼周圍腫脹，結(jié)膜充血，水腫，有時(shí)有點(diǎn)狀出血，下眼瞼水腫，角膜出現(xiàn)潰瘍等病理變化。少數(shù)病雞在氣管黏膜表面有一層假膜，全身器官組織嚴(yán)重瘀血。

雞傳染性喉氣管炎的臨診癥狀和病理變化與某些呼吸道傳染病，如雞新城疫、傳染性支氣管炎有些相似，易發(fā)生誤診?，F(xiàn)場(chǎng)可通過(guò)以下幾點(diǎn)診斷：①本病常突然發(fā)生，傳播快，成年雞發(fā)生最多；發(fā)病率高，死亡因條件不同而差別大。②臨診癥狀較為典型，張口呼吸、喘氣、有啰音，咳嗽時(shí)可咳出帶血的粘液；有頭向前向上吸氣姿勢(shì)。③剖檢死雞時(shí)可見(jiàn)氣管呈卡他性和出血性炎癥病變，以后者最為特征；氣管內(nèi)還可見(jiàn)到數(shù)量不等的血凝塊；如有條件可結(jié)合病毒分離、鑒定和動(dòng)物接種來(lái)進(jìn)一步確診。

二、實(shí)驗(yàn)室診斷

（一）病毒分離鑒定技術(shù)

1.病料采集和運(yùn)輸。病料的準(zhǔn)備：①活體采樣。用滅菌棉拭子伸入口咽或氣管采集分泌物，放入含青霉素4 000 IU/ml和鏈霉素4 000 μ g/ml的無(wú)菌生理鹽水中。也可用棉拭子刮取眼分泌物，處理方法同上。②尸體采樣。無(wú)菌采取病死雞喉頭和氣管，放入無(wú)菌的平皿或燒杯中，密封。

采集的樣品應(yīng)立即放入4℃冰箱保存，24 h內(nèi)送到實(shí)驗(yàn)室；不能在24 h內(nèi)送到實(shí)驗(yàn)室時(shí)，應(yīng)將所采樣品冷凍保存和運(yùn)輸。

2.樣品處理。

（1）收到棉拭子樣品后，先凍融2次，并充分振動(dòng)、擠干棉拭子，將樣品液經(jīng)10 000 r/min離心10 min，取上清液，加入青霉素4 000 IU/ml、鏈霉素 4 000 μ g/ml，于 37℃作用30 min，作為接種材料。

（2）組織樣品：無(wú)菌條件下將組織剪碎，按1：4加入生理鹽水后用研磨器研磨制成20%的勻漿懸浮液，再經(jīng)10 000 r/min離心10 min，取上清液，加入青霉素4 000 IU/ml，鏈霉素 4 000 μ g/ml，于 37℃作用30 min，作為接種材料。

3.接種雞胚。取經(jīng)處理過(guò)的樣品，接種9～12日齡的雞胚絨毛尿囊膜。每枚0.2 ml，接種后的雞胚在37℃孵育，每天觀察雞胚2次，連續(xù)觀察7 d，棄去24 h內(nèi)死亡的雞胚，24～120 h內(nèi)死亡的雞胚，放4℃冷卻后，觀察雞胚絨毛尿囊膜上有無(wú)痘斑形成；120 h仍不死亡的雞胚，亦取出，置4℃冷卻后，觀察雞胚絨毛尿囊膜上有無(wú)痘斑形成。有痘斑者，取出雞胚絨毛尿囊膜和尿囊液，無(wú)菌研磨后，置-20℃凍存?zhèn)溆茫粺o(wú)痘斑者，亦取出雞胚絨毛尿囊膜和尿囊液，無(wú)菌研磨，反復(fù)凍融，離心后，接種9～12日齡的雞胚絨毛尿囊膜盲傳。盲傳3代以上，如仍無(wú)病變，則判為雞傳染性喉氣管炎陰性。

4.病毒鑒定。用雞傳染性喉氣管炎標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清（效價(jià)在1∶32以上）和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清與分離物作雞胚中和試驗(yàn)。

（1）血清處理。將傳染性喉氣管炎標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清56℃滅活處理30 min。

（2）病毒稀釋。將病毒分離物用含青霉素1 000 IU/ml和鏈霉素1 000μ g/ml的滅菌生理鹽水做10倍系列稀釋。

（3）病毒-血清混合液。設(shè)兩排試驗(yàn)管，每排4個(gè)管，第1排每管放0.6 ml標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清，第2排每管放0.6 ml陰性血清，然后向每排1～4號(hào)試驗(yàn)管內(nèi)分別加入(2×10-2～2×10-5）稀釋的病毒懸液各0.6 ml，將病毒-血清懸液混合并置冰箱(4℃～8℃）4 h。

（4）雞胚接種及結(jié)果判定。取經(jīng)處理過(guò)的病毒-血清混合液，分別接種9～12日齡的雞胚絨毛尿囊膜，0.2 ml/枚，每管接種5枚，接種后的雞胚在37℃孵育，每天觀察雞胚2次，連續(xù)觀察7 d，棄去24 h內(nèi)死亡的雞胚，24～120 h內(nèi)死亡的雞胚，放4℃冷卻后，觀察雞胚絨毛尿囊膜上有無(wú)痘斑形成；120 h仍不死亡的雞胚，亦取出，置4℃冷卻后，觀察雞胚絨毛尿囊膜上有無(wú)痘斑形成。記錄觀察結(jié)果，按Reed-Muench方法計(jì)算EID50。

5.結(jié)果判定。如分離物能引起雞胚絨毛尿囊膜出現(xiàn)典型的痘斑，并且經(jīng)雞胚中和試驗(yàn)，其陰性血清組和陽(yáng)性血清組的EID50的對(duì)數(shù)之差大于或等于2.5時(shí)，則判定分離物為雞傳染性喉氣管炎病毒。

（二）瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)用含8%氯化鈉的蒸餾水加萬(wàn)分之一疊氮鈉配制成1%瓊脂糖，103kPa高壓蒸汽滅菌或水浴加熱使瓊脂充分溶化，加入直徑為85 mm的培養(yǎng)皿中，每皿16 ml，平置，室溫下凝固后，置4℃?zhèn)溆谩Ｔ诃傊瞧矫笊?，按坐?biāo)紙上畫(huà)好的梅花型打孔，孔徑4 mm，孔間距3 mm。挑出孔內(nèi)瓊脂，在火焰上封底。用微量移液器加樣，中央孔加抗原，1、3、5孔加標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清，2、4、6孔加待檢血清，每孔均以加滿不溢出為度。加樣完畢后，靜置10 min，放入37℃帶蓋的濕盒中反應(yīng)，分別在12 h、24 h、36 h觀察并記錄結(jié)果。被檢樣品孔與中央孔之間形成清晰的沉淀線，并與標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清孔的沉淀線相融合者為陽(yáng)性。被檢血清孔與抗原之間無(wú)沉淀線，標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清孔與抗原孔之間的沉淀線直伸向被檢血清孔的邊沿?zé)o彎曲者，判為陰性。

（三）血清中和試驗(yàn)（SN）將ILTV特異性的血清和待檢病料一起孵育后接種雞胚或細(xì)胞進(jìn)行血清中和試驗(yàn)，根據(jù)雞胚絨毛尿囊膜（CAM）上或細(xì)胞的痘斑數(shù)量的有無(wú)或多少判定，檢測(cè)自然感染或試驗(yàn)感染的血清抗體時(shí)，ILTV接種后一周即可測(cè)出中和抗體。

（四）包涵體檢查用棉拭子采取發(fā)病后2～3 d雞喉頭黏膜上組織制成切片，姬姆薩染色、鏡檢。取發(fā)病后2～3 d的雞喉頭黏膜上制成切片后，姬姆薩染色，鏡下發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)有紫色、周圍有暈輪狀的包涵體即可判為陽(yáng)性。

（五）動(dòng)物回歸試驗(yàn)以病毒分離物經(jīng)氣管內(nèi)途徑接種易感雞，然后常規(guī)飼養(yǎng)，記錄發(fā)病情況，3～7 d后撲殺檢查。具體操作如下：取病雞氣管分泌物，按1∶5加生理鹽水稀釋，用棉簽蘸取稀釋液涂擦喉頭和上腭，接種60日齡易感雞10只，再用生理鹽水接種同日齡雞10只作對(duì)照。3～7 d后可見(jiàn)感染雞出現(xiàn)ILT典型臨床癥狀和病理變化，易感雞出現(xiàn)呼吸困難，流淚，結(jié)膜發(fā)炎，眶下竇，鼻竇腫脹。剖檢病雞發(fā)現(xiàn)喉頭和氣管出血嚴(yán)重，而對(duì)照組均無(wú)異常變化。

（六）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）該方法可以快速、敏感地做出診斷，一次可檢測(cè)多個(gè)樣品，可用于ILTV抗體的檢測(cè)和定量，但對(duì)抗原的純度要求很高。具體操作方法可參考試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

（七）分子生物學(xué)診斷

1.PCR檢測(cè)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)簡(jiǎn)稱PCR，是一種體外快速擴(kuò)增DNA的方法，用于放大特定的DNA片段，數(shù)小時(shí)內(nèi)可使目的基因片段擴(kuò)增到數(shù)百萬(wàn)個(gè)拷貝的分子生物學(xué)技術(shù)。

采用病毒DNA抽提試劑盒，直接從疑似ILT感染病料，或者病料接種后獲得的病毒產(chǎn)物中提取DNA。采用1對(duì)特異性引物d00565-1（5’-GGCAACGGATTC CGGCATTTAGTC-3’）/d00565-2（5’-GACGCCTCCCGACATTCAA GTTTT-3’），按下列反應(yīng)程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增：95℃3 min；94℃40 s，58℃ 40 s，72℃ 40 s，共進(jìn)行 30個(gè)循環(huán)；然后72℃保溫10 min。用1%濃度的瓊脂凝膠電泳，120V30 min，見(jiàn)有335bp大小的帶即可判定為陽(yáng)性，否則為陰性。

2.分子雜交技術(shù)。該技術(shù)的運(yùn)用使ILTV不同毒力的鑒別，以及與其他禽病毒的區(qū)分成為可能。不僅對(duì)鑒定ILTV提供安全有效的手段，而且能快速、簡(jiǎn)便地檢出潛伏期感染的ILTV，但不能可靠地在原始病料中檢出病毒。

3.環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增 (LAMP） 是最近開(kāi)發(fā)的一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)。其特點(diǎn)是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域, 設(shè)計(jì)4種特異引物，利用一種反轉(zhuǎn)錄酶（AMV反轉(zhuǎn)錄酶）和一種鏈置換DNA聚合酶(Bst dNA polymerase）在恒溫(65℃左右）中保溫1 h左右，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)果可以通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳觀察，或者直接靠擴(kuò)增副產(chǎn)物焦磷酸鎂的沉淀濁度進(jìn)行判斷，也可以通過(guò)在終產(chǎn)物中加入染料的方法直接用肉眼觀察結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)室針對(duì)傳染性喉氣管炎病毒的胸苷激酶基因（TK），設(shè)計(jì)一套引物，在65℃下反應(yīng)1 h，可以檢測(cè)到目標(biāo)產(chǎn)物，其靈敏度比常規(guī)PCR技術(shù)高10倍。

三、鑒別診斷

臨床上傳染性喉氣管炎與雞新城疫、傳染性支氣管炎、禽霍亂等有部分相似，需做好鑒別診斷。必要時(shí)要根據(jù)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果做出科學(xué)的診斷。

（一）雞新城疫 雞新城疫和傳染性喉氣管炎病原都是病毒，傳染快，發(fā)病率高，同樣有呼吸困難病狀。但傳染性喉氣管炎無(wú)神經(jīng)癥狀及拉稀等消化道癥狀。病理變化局限于喉部和氣管，呈現(xiàn)出血性或假膜性喉炎及氣管炎。

（二）雞傳染性支氣管炎傳染性支氣管炎主要感染30日齡以內(nèi)的雛雞，也出現(xiàn)呼吸困難，但表現(xiàn)為支氣管炎及肺炎病變明顯。而傳染性喉氣管炎侵害較大日齡的雞(4～12個(gè)月）。病變?cè)跉夤芗昂聿?，其中含大量粘液性、壞死性物質(zhì)。

（三）黏膜型雞痘如呼吸困難，口腔檢查亦見(jiàn)喉頭處被干酪樣物所堵塞，病死雞剖檢可見(jiàn)喉頭、氣管栓塞等癥狀與傳染性喉氣管炎極相似。但黏膜型雞痘在喉頭處黏膜可見(jiàn)隆起的單個(gè)或融合在一起的灰白色痘斑。一般不見(jiàn)氣管的急性出血性炎癥。

（四）禽霍亂禽霍亂往往僅流行于個(gè)別雞群或小范圍，若在同一地區(qū)雞鴨鵝同時(shí)大批發(fā)病死亡，則可能是禽霍亂，而不是傳染性喉氣管炎。禽霍亂病程短，一般在1～2 d內(nèi)死亡。剖檢死于禽霍亂的雞，可見(jiàn)肝臟上常有灰黃色壞死點(diǎn)，心包膜內(nèi)有大量的纖維蛋白性滲出液。全身漿膜、黏膜出血，細(xì)菌檢查可檢出巴氏桿菌。這些是傳染性喉氣管炎所不具有的。

（五）維生素A缺乏癥病程呈慢性，初期咽和食道沒(méi)有纖維蛋白性覆蓋物，而有膿皰樣小結(jié)節(jié)，在上呼吸道的上皮細(xì)胞和黏膜腺中可見(jiàn)角化病變，無(wú)氣管急性出血性炎癥變化。