絲素蛋白調控磷酸鈣生物礦化的研究進展

沈 彤(紹興文理學院 元培學院，浙江 紹興 312000)

絲素蛋白調控磷酸鈣生物礦化的研究進展

沈 彤
(紹興文理學院 元培學院，浙江 紹興 312000)

總結了當前蠶絲蛋白仿生礦化領域研究的熱點內容，闡述了以不同形態(溶液、膜、粉末和纖維)存在的絲素蛋白基質對磷酸鈣晶體生長的調控作用，介紹了蠶絲蛋白對磷酸鈣晶體形態和結構的影響。

蠶絲蛋白；磷酸鈣；基質調控；生物礦化

天然骨是自然界最復雜的生物礦化系統之一，由無機礦物與有機大分子規則排列而成。其無機相具有多型性，最主要的成分是羥基磷灰石(HA)，又含有CO32-、Cl-、F-、Na+、Mg2+等雜質離子，其中CO32-的含量較高，CO32-可取代OH-或PO43-的位置而形成α型或β型碳酸磷灰石(CHA)，一般骨中這兩相同時存在。此外，骨中還存在非晶磷酸鈣(ACP)、磷酸八鈣(OCP)、二水磷酸氫鈣(DCPD)和六方碳酸鈣等多種礦物相，作為磷灰石的前體相而存在[1]。在整個礦物形成過程中，晶體形核的位點、取向、形狀及最終生成的物相都依賴于礦化過程中存在的有機成分及其在礦化生長階段起到的精密調控作用。而生物體究竟是怎樣通過蛋白質來實現對晶體晶型和形貌的調控作用的一直是研究者關注的焦點問題。因此，在體外環境中模擬體內環境，利用有機模板仿生合成類骨材料已成為骨組織工程的重要研究內容之一。

蠶絲蛋白是一種性能優良的天然生物材料，具有優異的力學性能、生物相容性和生物可降解性，且與膠原蛋白同屬結構蛋白，提取方法簡便，成本低廉，能促進細胞的黏附、擴展和分化，在研究開發骨修復和替代材料方面，已顯現出廣闊的前景。近年來，人們嘗試多種方法將蠶絲蛋白制備成不同的結構和形態，仿生合成生物復合材料運用于骨組織工程。

1 蠶絲蛋白調控磷酸鈣生物礦化的研究進展

1.1 絲素溶液調控磷酸鈣生物礦化

孔祥東等[2]曾以溶液態的絲素蛋白為有機模板，在pH8、室溫條件下調控磷酸鈣的礦化過程，研究了不同反應時間收集的磷酸鈣沉淀的形貌、物相及結構。TEM圖譜表明生成的復合顆粒呈棒狀，其直徑約2～3 nm，其選區電子衍射表明生成礦物呈多晶環狀，XRD分析結果表明所得磷酸鈣為羥基磷灰石晶體，且HA具有(002)擇優取向。采用FTIR對形成的晶體進行了化學結構分析，結果表明HA晶粒是部分碳酸根取代的HA，且礦化過程絲素蛋白的二級結構發生變化，其酰胺Ⅱ吸收峰位置發生藍移(由1 517 cm-1到1 539 cm-1)，說明HA和絲素蛋白間形成強烈的化學相互作用。孔祥東等[3]還采用UV/可見光譜技術追蹤研究了蛋白濃度對磷酸鈣礦化的影響。實驗發現蠶絲蛋白的加入極大地影響了生物礦化的動力學過程，較高濃度的蠶絲蛋白有助于生物礦化的進行。在適宜的反應條件下，蠶絲蛋白礦化的動力學曲線有波峰和波谷的出現，出現這種情況主要與相分離有關。XRD結果表明通過波谷前的磷酸鈣主要是非晶磷酸鈣，而波谷后的磷酸鈣成分主要是羥基磷灰石和二水磷酸氫鈣。孔祥東等[4]所制備的磷酸鈣呈現直徑約2～3 nm的纖維狀，這些納米纖維可以聚集成束，直徑為6～8 nm，長度可達30～60 nm。

姚菊明等[5]以堿金屬離子誘導桑蠶絲素蛋白溶液發生構象轉變，研究了蛋白質初始結構對其礦化作用的影響。FTIR、XRD和SEM等測試結果顯示，未經任何處理的桑蠶絲素蛋白溶液礦化后形成片狀復合物，其無機相以DCPD為主，而經過K+和Na+金屬離子處理后，桑蠶絲素蛋白的構象由無規線團/螺旋結構向β-折疊轉變，礦化后成纖維狀，并相互結合呈現納米級的三維多孔結構，其無機相以熱力學穩定的HA為主。實驗認為，絲素蛋白結構轉化為較伸展的β-折疊后，使得更多的親水基團暴露在外面，在絲素蛋白分子不斷凝聚成纖過程中，HA結晶快速生長并附著在這些微纖上，最終形成纖維狀的絲素蛋白/HA復合物。此外，該研究組[6]還在絲素蛋白/磷酸鈣復合材料形成過程中加入不同量的Na2SiO3，以評價硅對復合材料中磷酸鈣晶體生成的影響作用。FTIR和XRD結果表明，當Na2SiO3最終質量分數低于0.008 %時，復合材料中的無機相主要是DCPD，也就是骨中HA生成的前體。相反的，高于該質量分數，復合材料中的無機相則主要是HA。且Na2SiO3質量分數偏低時，形成的磷酸鈣晶體呈片狀，而更高質量分數時則為棒狀。棒狀晶體相互交聯成網絡結構，這是因為HA生成的同時伴隨著絲素蛋白組裝成微纖維。這一過程中，絲素蛋白構象也從α-螺旋轉變為反向β折疊結構。TG分析結果表明SiO32-的加入，復合材料具有更好的熱穩定性。該研究組的研究結果為闡明蛋白質的生物礦化過程及其調控機理提供了理論依據，同時可以從礦化復合物的形成來反映這些微量元素可能對骨組織形成的影響, 為臨床骨組織的修復提供一定的參考。

1.2 絲素蛋白膜調控磷酸鈣生物礦化

姚菊明研究組[7]以絲素蛋白膜為基質，在模擬體液中誘導羥基磷灰石晶體在其表面沉積和生長。利用XRD，SEM，HRTEM，AFM和FTIR等表征手段研究了不同預處理方法對羥基磷灰石晶體的形成及其微觀形貌的影響。結果表明，絲素膜可有效地誘導羥基磷灰石晶體在其表面沉積和生長，HA晶體呈針狀晶須或由針狀晶須組裝成簇狀形式規律分布在膜表面。絲素蛋白膜調控羥基磷灰石晶體生長的機制研究表明礦化時間主要從結晶度和晶體形成數量方面對HA晶體產生影響，而預處理方法則影響了HA晶體的生長方式。這主要是由于不同的預處理，改變了絲素蛋白膜的表面結構，使得蛋白膜表面親水基團重新排列，增加了Ca2+和/或PO43-等的結合位點，且這些位點組成的矩陣具有一定的排列特性，其排列方式與HA晶體的某些晶面上較長鈣磷離子的排列方式相匹配，致使晶體成核及生長過程中發生擇優取向。

Kino等[8]通過鑄膜及甲醇處理制備了不同氯化鈣含量的絲素蛋白膜，然后將得到的絲素膜浸泡在1.5倍模擬體液(1.5 SBF)中，研究沉積的磷酸鈣晶體結構。試驗發現CaCl2質量分數低于3 %的絲素膜不發生礦化作用，而質量分數高于3 %的絲素膜在6 h后發生礦化作用。X射線衍射和ICP直流等離子體發射光譜分析表明：HA是由水解后的磷酸鈣生成，這可由衍射強度的變化及1.5 SBF條件下鈣離子和磷酸根離子濃度的變化而知。隨后，將質量分數為5 % CaCl2的絲素蛋白膜浸泡在模擬體液中沉淀生成HA晶體。通過熱壓縮法，即130 ℃和3 MPa條件下處理4 min后制備多層HA/SF 復合膜和純SF膜(4層)。2種樣品中的β折疊構象含量相差不多，分別為55.8 %和55.1 %。將2種膜材料分別置于含有和不含蛋白酶XIV的磷酸緩沖液中處理1～14 d，檢測膜的膨脹率和體外降解率，同時對樣品的質量和張力的改變情況進行了研究。與純SF膜相比，含有HA的多層膜降解緩慢，且具有更高的機械強度[9]。

1.3 絲素蛋白粉調控磷酸鈣生物礦化

Wang等[10]對絲素蛋白粉進行預處理，通過濕態機械化學法合成了包含羥基磷灰石和絲素蛋白的納米復合材料。試驗首先將絲素蛋白粉(SF)均勻分散在Ca(OH)2溶液中進行堿液預處理，然后向該懸浮液中加入H3PO4溶液，合成了HA/SF納米復合材料。堿性溶液處理SF顆粒，增加絲素基質和鈣磷離子的接觸位點。使得到的HA晶粒在SF基質上沿著晶體學c-軸擇優生長。合成的復合材料顯示了70%開放多孔結構，且內部孔的直徑在40～115 μm之間。絲素蛋白酰胺Ⅱ峰位置的變化表明，堿性溶液預處理SF加強了HA晶粒與SF基質間的化學作用。這種較強的無機－有機相互作用促進了三維網絡結構貫穿材料內部，并引起材料維氏硬度增加了63 %。Wang等[11]還采用蛋白酶K化學修飾絲素蛋白來加強HA基納米復合材料中無機相和有機相之間的化學相互作用，取得了同樣的結果。對復合材料中HA結晶學性能和材料顯微結構、顯微硬度的研究表明，HA納米晶須在沿c-軸生長時表現了較強的取向性自組裝和各向異性的晶體生長特性。合成的復合材料顯示了70 %開放多孔結構，孔粒徑分布在10～115 μm范圍內。由于酶的修飾作用，HA晶簇和SF基質的交聯度提高，增加了復合材料中的網絡結構，使得復合材料的顯微硬度提高了35 %。此外，HA/SF納米復合材料中SF含量對復合材料微觀結構和物理化學性質也有很大的影響[12]。SF的加入，使HA沿c-軸和α-軸方向的生長都受到了抑制。當SF的質量分數為30 %時，材料內部顆粒形貌相近，HA晶粒分散均勻，材料呈現三維網絡結構。而當其質量分數增加到40 %時，材料微粒尺寸分布范圍縮小，復合物的Vickers顯微硬度增加4倍。復合材料具有多孔微觀結構，孔隙率為62 %～74 %，微孔直徑約70 %分布在40～115 μm之間。

基于Wang等[13]的研究可以發現，堿液和酶預處理的絲素暴露出更多的活性位點，誘導HA沿c-軸的擇優取向，并有效改善無機相和有機相之間的界面結合，促進復合材料三維網絡結構的形成，增加纖維硬度。

1.4 絲素纖維調控磷酸鈣生物礦化

人體骨是由無機磷灰石晶體和有機的膠原纖維構成的高度有序的三維復合結構。為了仿生制備該類生物復合材料，一個令人矚目的戰略便是選擇性地使磷灰石晶體在聚合物上生長，并對其結構、機械強度和功能進行控制。Tamada等[14]采用polymethacryloylox yethylphosphate(pMOEP)接枝蠶絲織物。與未處理蠶絲織物相比，pMOEP接枝后，蠶絲織物對Ca2+吸附能力明顯提高。SEM觀察顯示在模擬體液中浸泡1周之后，pMOEP接枝的蠶絲織物上沉積有微晶體，而未處理的蠶絲織物上卻沒有發生結晶現象。X射線衍射表明微晶中包含有羥基磷灰石。該結果表明pMOEP接枝后的蠶絲織物比未處理織物更能有效誘導羥基磷灰石晶體形成。

Furuzono等[15]以蠶絲織物為模板，通過循環浸泡處理過程制備了沉積鈣磷鹽的蠶絲復合材料，并用SEM，XRD，FTIR以及XPS對沉積的磷酸鈣形貌和結構進行研究。在Ca2+溶液(200 mM CaCl2-tris-HCl緩水溶液，pH7.4)和PO43-溶液(120 mM Na2HPO4)中每隔1 h輪流浸泡后，磷酸鈣的沉積量相應增加。SEM觀察表明經21次或更多次的循環浸泡之后，磷酸鈣的沉積厚度已超過20 μm。XRD顯示經過循環浸泡，沉積的磷酸鈣晶體的長徑比增加。FTIR和XPS表明，除了構成羥基磷灰石的基團，沉淀中還有CO32-，HPO42-和Na+離子。在繼續浸泡的過程中，沉積物中HPO42-和Na+含量降低，這與磷酸鈣結晶度的增加有關。通過循環浸泡，在蠶絲蛋白上沉積的磷酸鈣中是一種缺陷型晶體，和天然骨組織中類似，包含CO32-，HPO42-和Na+等離子。因此，這種磷酸鈣-蠶絲蛋白復合材料可能是具有生物活性的。

Li等[16]通過在電紡絲制備的具有納米直徑的活化絲素纖維上沉積磷灰石而制備了絲素/磷灰石三維復合材料。活化絲素由絲素/PEO(polyethylene oxide)水溶液紡絲而得，作為天然骨中非膠原蛋白的類似物，該溶液中引入了多聚天冬氨酸(poly-Asp)。絲素蛋白以及酸性poly-Asp充當了礦化的模板。磷灰石礦物沿纖維的長軸方向擇優生長，而在缺少模板蛋白時，該現象即使在合適的反應濃度下也不會出現。能譜和XRD證實了沉積的礦物是磷灰石。Zhao等[17]將靜電紡絲制備的絲素無紡布交替在鈣鹽溶液和磷酸鹽溶液中浸潤制得SF/HA復合支架材料。復合材料中HA晶體呈現納米尺寸的針狀形態，直徑為20～60 nm，長度為100～300 nm。復合支架材料具有多孔微結構，孔尺寸平均在(163±40 μm)，孔隙率達70 %～78 %。復合材料顯示了良好的親水性，其膨脹率和吸水率分別為4.55 %和81.93 %。該材料用于成骨細胞培養，顯示了良好的細胞相容性。

2 蠶絲蛋白調控磷酸鈣生物礦化的發展趨勢

仿生礦化是開發新型生物材料的有效方法。蠶絲蛋白作為天然高分子蛋白質，具有優良的機械性能和生物相容性，易于加工成型。經過處理得到的絲素蛋白溶液、絲素膜、絲素粉末及絲素纖維均可誘導磷酸鈣等無機礦物的沉積和生長。通過改變蠶絲蛋白初始結構，對蠶絲蛋白表面功能基團預處理等手段，可有效調控磷酸鈣晶體的形貌和化學結構，這對認識有機模板在調控晶體形核、生長及微結構的有序組裝過程中發揮的調控作用提供科學參考，也為研制出更理想的人工骨組織工程材料提供實驗依據。但一直以來，研究者仍無法模擬合成出類自然骨、牙的硬組織材料，其主要原因是生物體內的礦化是在有活細胞參與及多種調控情況下，在蛋白基質上進行的復雜而有序的精密過程，因此，未來的研究不僅是研究礦化位點基質組成和位點附近介質的影響，還要探索細胞及基因對礦化過程的調控作用。

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Developments of Current Researches on Biomineralization of Calcium Phosphate Regulated by Silk Fibroin

SHEN Tong
(Department of Life Science, Yuanpei College, Shaoxing University, Shaoxing 312000, China)

As a natural biomaterial, silk fibroin has outstanding mechanical properties, biocompatibility and biodegradation, which provides an important basis for exploiting this protein for tissue engineering applications. In this paper, biomineralization of calcium phosphate regulated by various forms silk fibroin (solution, film, powder and fiber) was reviewed, the effect of silk fibroin on the morphology and structure of calcium phosphate was analyzed. Thereout, the strategies in biomineralization of calcium phosphate was presumed.

Silk fibroin; Calcium phosphate; Stroma regulation; Biomineralization

O629；O636

A

1001-7003(2010)07-0023-04

2010-04-18

國家自然科學基金(10672145)；浙江省自然科學基金(Y205468)

沈彤(1986－ )，男，本科生，專業為生物科學。