食物過敏原表位定位技術的研究進展

武 涌，李 欣，陳紅兵,*，高金燕

(1.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.南昌大學中德聯合研究院，江西 南昌 330047；3.南昌大學生命科學與食品工程學院食品系，江西 南昌 330047)

食物過敏原表位定位技術的研究進展

武 涌1,2，李 欣1,3，陳紅兵1,2,*，高金燕3

(1.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.南昌大學中德聯合研究院，江西 南昌 330047；3.南昌大學生命科學與食品工程學院食品系，江西 南昌 330047)

表位是過敏原的物質基礎，表位定位技術是過敏原表位研究的工具，包括表位定位和表位預測兩種。新的表位定位技術主要包括噬菌體展示技術、質譜技術、表面等離子共振技術、蛋白芯片技術、核磁共振技術。相比于傳統的過敏原表位定位技術，新的表位定位技術在靈敏度、準確性和快速等方面具有優勢。表位預測是運用生物信息學方法對過敏原表位進行預測。本文將對新的表位定位技術在表位定位中的應用、表位預測以及相關應用進展進行闡述。

食物過敏；表位定位技術；表位預測

過敏原主要成分是蛋白質。過敏原表位是指抗原中參與抗體結合的部分，由5～7個氨基酸組成。表位是過敏原與抗體結合的物質基礎，也是食物過敏反應的“元兇”。根據其結合受體細胞的不同，分為B細胞表位和T細胞表位；按表位結構的不同分為連續性表位和非連續性表位，前者又稱線性表位，是由肽鏈上順序連續的氨基酸組成的，后者又稱構象性表位，是由空間鄰近但順序上不連續的氨基酸組成的[1]。線性表位見于T細胞表位和部分B細胞表位，構象性表位存在于B細胞表位。不連續表位是近年提出的一種新的表位概念，是指抗原中幾個不同區域的氨基酸序列在三維空間中形成的具有活性的表位[2-3]。

傳統的表位定位技術如酶解技術、肽掃描技術有特異性差、費時和昂貴等缺點，而新的過敏原表位定位技術從噬菌體展示技術誕生開始有了新近展，1990年Scott等[4]首次將噬菌體隨機多肽庫應用于篩選抗原模擬表位。1999年，Mendoza等[5]基于ELISA檢測原理將微孔板與蛋白微陣列方法相結合，創立了具有微型化、集成化、高通量化等優點的微孔板陣列蛋白芯片，至此拉開了蛋白芯片在過敏原表位定位應用的序幕。20世紀90年代發展起來的表面等離子共振技術是Fagerstam等[6]在生物特異性相互作用分析方面得到了廣泛的應用。

核磁共振技術(NMR)是由Bloch等在1946年發現的，最近幾年才應用于表位的篩選工作中[7]。質譜技術中的基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)是19世紀80年代末問世并迅速發展起來的質譜分析技術，也是最近幾年才用于篩選表位，也是表位定位最多的一種手段。表位預測主要是采用生物信息學的方法，對抗原表位進行預測。

食物過敏表位的定位不僅可以了解過敏原的結構與功能、抗原抗體反應等有關免疫反應的眾多信息，而且對食物過敏原的檢測、監控等方面也具有指導意義。

1 表位定位技術種類

表位定位主要分為表位預測和實驗性定位兩種。表位預測主要是根據蛋白質中氨基酸本身的特性和氨基酸的組成特點，預測構成表位的可能性。實驗性定位主要有酶解技術、肽掃描技術、噬菌體展示技術、質譜技術、表面等離子共振技術、蛋白芯片技術和核磁共振技術等。本文主要探討新的表位定位方法、表位預測以及應用進展。

2 表位定位技術的研究進展

2.1 噬菌體展示技術(phage display techniques)

早在1985年，Smith[8]第一次將外源基因插入絲狀噬菌體f1的基因Ⅲ中，使目的基因編碼的多肽以融合蛋白形式展示在噬菌體表面，從而創建了噬菌體展示技術(phage display techniques，PDT)，該技術建立了基因與融合蛋白的統一，使基因型和表型直接和有效的對應。目前，用于蛋白質、多肽展示的噬菌體系統有絲狀噬菌體展示系統、λ噬菌體展示系統、T4噬菌體展示系統、T7噬菌體展示系統和噬菌粒展示系統。構建的商業化肽庫短肽長度已由最初的6肽、7肽發展到9肽、15肽以至38肽、40肽[9]。噬菌體展示技術作為一項高通量篩選技術，現已被廣泛地運用于抗原表位的定位，人工制備抗體，確定激素或受體的結合序列或酶的底物序列，篩選受體的激動劑或拮抗劑或酶的抑制劑等。

目前，運用不同的噬菌體庫，可以篩選過敏原的線性表位和構象性表位的模擬肽，然后通過生物信息學的方法把模擬肽轉變成相應的表位。如，李欣等[10]以兔抗水牛乳β-乳球蛋白的抗體IgG為固相篩選分子，免疫篩選噬菌體隨機7肽庫，確定了6個與兔血清IgG結合的水牛乳β-乳球蛋白線性表位。另外，小清蛋白分子質量約為12kD，可以被超過90%的過敏患者的血清所識別，是魚類食物中一種主要過敏原，以此過敏原為對象，Untersmayr等[11]使用M13衣殼蛋白PⅢ噬菌體展示文庫對小清蛋白的表位進行篩選，通過4輪的篩選富集，分別得到5個同時與人血清IgG、IgE結合的陽性克隆，對所選克隆進行DNA序列分析，確定了3個模擬構象表位。

2.2 質譜技術

質譜技術(mass spectrometry)主要是針對分子間的非共價鍵反應如抗原-抗體間的特異性結合進行分析，其具有靈敏度高、樣品用量少、分析速度快、分離和鑒定同時進行等優點，已得到廣泛的應用。在定位表位的研究中，已發展出與質譜技術結合的一些技術，如酶解技術、表位足跡技術等。對于線性表位可以采取表位分離和表位提取技術，已有相關文獻[12]對于此類方法進行報道。而在定位構象性表位時，則需要對肽段中的氨基酸進行不同的化學修飾或通過H/D的交換對蛋白骨架進行分析，進而得到過敏原的構象性表位[13]。其中，基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOFMS)結合免疫親和的親和質譜技術是目前抗原表位分析的有效方法[14]。

親和質譜是免疫親和分離技術與現代質譜技術的結合，通過親和質譜，是篩選抗原表位的有效方法，不僅可以直接獲取抗原表位的準確分子質量，而且還可以獲得抗原存在與否、抗原表位位點和氨基酸序列等信息。將肽段混合物與單克隆抗體進行作用，免疫沉降后，將特異性結合的肽段復合物與基質溶液混合直接進行MALDI-TOP質譜分析。此方法不需要分離得到結合后的肽段，質譜峰所對應的就是與抗體特異性結合的肽段。

牛乳α-乳白蛋白是一個球狀單體鈣結合蛋白(分子質量為14.2kD)約占乳清蛋白的25%。利用重組的牛乳α-乳白蛋白，Hochwallner等[15]通過親和質譜，對IgE結合表位進行分析，發現重組的α-乳白蛋白可以與57.6%的牛乳患者血清中的IgE發生特異性的結合。

另外，卵白蛋白(ovalbumi，OVA or Gal d 2)是蛋清中的主要過敏原，約占蛋清蛋白的54%。Lopez-Exposito等[16]將卵白蛋白在400MPa的環境下進行胃蛋白酶水解，水解肽進行了反相高效液相色譜串聯質譜(RPHPLC-MS/MS)分析，發現一些水解肽段含有能夠和患者IgE特異性結合的表位。

2.3 表面等離子共振技術

表面等離子體共振技術(surface plasmon resonance，SPR)是一種檢測結合動力學非常有用的方法。它是一種物理光學現象，當入射光以臨界角入射到兩種不同透明介質界面時，可引起界面金屬自由電子共振，電子能夠吸收光能量從而使反射光在一定角度內減弱，其中使反射光完全消失的入射光角度稱為共振角[17]。SPR隨金屬表面的折射率變化而變化，而折射率的變化又和結合在金屬表面的生物分子質量成正比。因此，可以通過對生物反應過程中共振角的動態變化獲取生物分子相互作用的特異信號。檢測表面等離子共振的儀器有Biacore

2000[18]，該系統可用于抗體鑒定、蛋白質組學、免疫原性等領域的應用。該技術具有無需標記、高通量實時分析的優點，現已廣泛應用于研究各種分子相互作用的特性，包括抗體-抗原結合、配基-受體結合以及蛋白和DNA等的結合[19]，將表面等離子體共振技術與基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術進行對比，發現這兩種方法在檢測抗原-抗體結合方面具有很強的互補性，表面等離子技術需要的樣品量低，但步驟繁瑣；基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術不能直接檢測動力學常數，但檢測速度更快，分析比較容易[20]。這兩種技術也可結合進行表位的定位，例如生物相互作用分析質譜就是該技術與基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜結合的產物。綜合表面等離子技術與質譜技術對過敏原表位進行定位，可實現定量與定性的結合。SPR技術在抗原-抗體結合動力學及抗原表位-抗體對位的篩選中具有重要的作用。通過標記抗原-抗體、動態反應抗體-抗原的結合與解離速率和親和常數，從而監控特異性的抗原抗體反應。基于這種方法，可以篩選酶解后的線性表位或結合肽文庫技術進行大量篩選。如，Karlsson等[21]運用SPR技術研究HIV-1核心蛋白P24與其單克隆抗體的結合動力學，通過芯片表面檢測抗原-抗體結合過程，得到17個P24抗體的特異性表位。

目前，在食物過敏原表位定位中，運用SPR技術的文獻暫未見報道，但類似的工作顯示了該技術在食物過敏原表位中的應用前景。

2.4 蛋白芯片技術

最近幾年在蛋白質組學的推動下，蛋白質芯片技術(protein microarray)發展很快，在生物學研究中已得到廣泛的應用。在蛋白表達譜、蛋白-蛋白相互作用、抗原表位篩選等方面，已有相關的文獻報道[22]。與傳統的ELISA免疫測定方法相比，蛋白芯片技術具有同時分析多個目標蛋白的功能，并具有高通量、檢測靈敏、樣品用量少等特點。

該技術的基本原理是將蛋白質或肽段有序地固定于載玻片等各種介質載體上成為檢測的芯片，然后，用標記有特定熒光物質的抗體與芯片作用，與芯片上的蛋白質相匹配的抗體將與其對應的蛋白質或肽段結合，抗體上的熒光將指示對應的蛋白質；再將未與芯片上的蛋白質互補結合的抗體洗去之后利用熒光掃描儀或激光共聚掃描技術，測定芯片上各點的熒光強度，通過熒光強度分析蛋白質與蛋白之間相互作用的關系，由此達到測定各種基因表達功能的目的。

蛋白芯片技術對于細微的表位變化非常靈敏，并且對血清的需求量也比較少，展示了在大量過敏原表位檢測方面的優越性。蛋白質徽陣列比傳統肽掃描技術(peptide scan)主要優勢在于使大量樣本的平行分析成為可能，在制備微陣列的過程中，可以通過點樣儀自動化的完成，并且在實際的操作中，能夠節約樣本和試劑的用量，縮短檢測時間，提高敏感性方面，相對于肽掃描技術，有很大的優勢。

應用蛋白芯片技術已成功地對牛乳過敏原等表位進行了研究。Lin等[23]通過合成含有牛乳主要過敏原表位的蛋白芯片，與5位牛乳過敏患者的血清進行特異性分析，發現以往運用SPOT技術定位出的表位在蛋白芯片上與IgE結合表位也有特異性反應，建立了運用蛋白芯片技術對牛乳過敏原表位進行大量定位的方法。此類方法也可運用到對其他食物過敏原表位定位的工作中。

目前為止，國際免疫聯合會命名小組委員會認可的花生過敏原有11種，主要的3個過敏原是Ara h1、Ara h2和Ara h3[24]。Shreffler等[25]將主要花生過敏原的213個重疊20肽固定在載玻片上，用77位花生過敏患者的血清和15位對照血清進行特異性分析，發現了一個特異性很高的Ara h 1表位，同時也以蛋白芯片技術再次認證了花生的主要過敏原。另外，Hochwallner[13]在對重組α-乳白蛋白表位的檢測過程中，也運用到了蛋白芯片技術來檢測重組肽段與血清的特異性結合。

2.5 核磁共振技術

核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)是處于靜磁場中的原子核在另一交變電磁場作用下發生的物理現象。因其具有迅速、準確等優點，該技術已廣泛應用于蛋白質-配體間作用、抗原-抗體間作用、膜蛋白的識別等方面的研究[26]。但相比于質譜技術、表面等離子共振技術，靈敏度不是很高。目前，隨著生物技術的發展，核磁共振已成為解析蛋白質空間結構的重要手段。核磁共振技術對表位定位的原理主要是根據抗原結合抗體與不結合抗體時，其位點的氨基酸殘基的動力學值不同進行分析。因此，可以區分抗原結合表位以及肽表位識別抗體邊緣殘基。其解析蛋白質結構主要包括兩個過程：1)化學位移指認；2)結構約束的測定。迄今為止，可以對小于30kD的蛋白質溶液三維結構進行測定。Pomes[27]指出通過X射線晶體衍射結合核磁共振技術，能夠對過敏原的構象性表位進行預測。

NMR技術可分為：1)分子間Overhauser效應(NOE)類；2)磁化轉移類；3)自擴散系數擾動類；4)弛豫速率擾動類；5)化學位移擾動類。分析蛋白質-配體分子間NOE結合同位素(15N、13C等)編輯/濾波技術，可獲得分子內和分子間的距離約束，通過相關軟件的分析，能夠得到抗原-抗體復合物的完整結構。如Wilkinson等[28]分析scFv片段與Fab片段間NOE結合同位素(15N/1H)編輯技術，研究scFv-IL-1β復合體的空間結構。類似的方法已經運用到抗原表位的篩選工作中，如HIV-1的表位定位的研究中已運用到此類技術[29]。核磁共振技術在進

行定位表位的工作中，也可結合其他的方法，如誘變[30]使得在定位構象性表位時更加準確。

在食物過敏原表位的研究中，有文獻報道[31]，通過X射線晶體衍射技術配合15N、15N-13C同位素標記的核磁共振，得到了櫻桃過敏原Pru av 1的三維空間結構以及IgE結合表位。

2.6 表位預測技術

目前，表位的預測主要包括B細胞線性表位、B細胞構象性表位、CTL表位及Th表位等抗原表位預測方法，其中CTL表位預測和Th表位預測是針對T細胞表位。

在預測B線性表位方面，主要公認的方法有6種：親水性方案、可及性方案、抗原性方案、可塑性方案、電荷分布方案和二級結構預測方案。對于構象性表位，則采用計算機預測和實驗相結合的方法進行分析和定位，一些可用的基于Web的預測軟件已經公布，如CEP軟件、Disc-Tope軟件和MEPS軟件。基于噬菌體展示篩選模擬肽的技術，是將獲得的親和性模擬肽集合進行對比，然后基于某種算法預測構象性表位。主要代表性的算法有Pepitope算法、3DEX算法和MIMOX算法，這3種方法都提供了網絡預測服務[32-34]。在預測構象性表位的方法中，還有Halperin等[35]提出的SiteLight算法，Mumey等[36]提出的FindMap算法以及Moreau等[37]提出的MIMOP算法，但運用最多的還是前面提供的3種算法。

在T細胞表位預測中，CTL表位預測主要是MHC I類分子肽預測，Th表位預測是MHCⅡ類分子的親和肽預測。MHC分子親和肽的預測方法主要有序列相似性預測法、分子建模法、結合基序法、定量矩陣法和機器學習法5種[38]。預測Th細胞表位比較先進的方法是機器計算法，該方法能夠提高預測的特異性、準確性和適用性[39]。

胡純秋等[40]采用SOPMA和DNAStar軟件預測該蛋白質的二級結構以及通Jameson-Wolf法、Kyte-Doolittle法、Emini法和Karplus-Schulz法分別預測其抗原指數、親水性、表面可及性、柔韌性等參數，得出序列28-31、56-73、76-90、156-158、168-169區域最可能是Ara h 2.02蛋白的B細胞抗原表位的優勢區域。

以上的預測方法還不能完全表現出體內的實際特異性結合情況，并且還存在著一些局限性，但隨著生物信息學的發展，食物過敏原表位預測必將會取得突破性的進展。

3 結 語

通過以上的綜述，不難發現在表位的定位過程中，噬菌體展示技術、質譜技術、表面等離子共振技術、蛋白芯片技術、核磁共振技術相比于傳統的技術在靈敏度、樣品用量、分析速度方面都有一定的優勢。根據不同的食物過敏原，在篩選過程中可以根據不同的需要選擇適合的方法。隨著對食物過敏原表位定位技術不斷豐富和完善，過敏原表位將會被更多的定位出來，對食物過敏原表位的認識也將更加透徹。檢測定位出的過敏原表位可替代對食物過敏原的檢測，使檢測結果更加準確，檢測方法將更加靈敏，食品的安全性也將隨著表位定位技術的發展而提高。

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Research Progress on the Epitope Mapping Technology for Food Allergens

WU Yong1,2，LI Xin1,3，CHEN Hong-bing1,2,*，GAO Jin-yan3
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China；2. Sino-German Joint Research Institute, Nanchang University, Nanchang 330047, China；3. Department of Food Science, School of Life Sciences and Food Engineering, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Epitopes is the material basis of allergens. Epitope mapping technology is the tool for studying allergen epitopes, which involves epitope mapping and epitope prediction. In recent years, there have been some newly emerging epitope mapping technologies include phage display techniques, mass spectrometry, surface plasmon resonance, protein microarray and nuclear magnetic resonance. Compared with the traditional epitope mapping technology, they have advantages of high sensitivity and accuracy as well as rapidity. Epitope prediction is a prediction of allergen epitopes achieved by means of the bioinformatics methods. This paper reviews the applications of the aforementioned epitope mapping technologies in epitope prediction and research progresses on epitope prediction.

food allergy；epitope mapping technology；epitope prediction

TS201.6

A

1002-6630(2010)23-0406-05

2010-08-11

教育部“新世紀優秀人才支持計劃”項目(NCET-08-07-04)；國家自然科學基金項目(30860220)；

南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室目標導向項目(SKLF-MB-200807)；江西省青年科學基金項目(2009GQN0089)

武涌(1985—)，男，碩士研究生，研究方向為食品科學分子生物技術。E-mail：CDkey918@163.com

*通信作者：陳紅兵(1967—)，男，教授，博士，研究方向為食品營養與安全。E-mail：chbgjy@hotmail.com