雷公藤多甙對體外培養的眼眶成纖維細胞增殖和透明質酸分泌的影響

常翠榮 孫豐源 于建國

(天津市寶坻區人民醫院眼科 天津寶坻 301800)

甲狀腺相關眼病(thyroid－associated ophthalmopathy，TAO)是眼眶常見病，其可影響患者的外觀，危及患者的視力，影響患者的正常生活。該病的發病機制不清，目前認為是一種自身免疫性疾病，多數學者認為眶后成纖維細胞是TAO自身免疫的靶細胞和效應細胞。目前TAO的治療較局限，缺乏特效的藥物。本實驗應用雷公藤多甙作用于體外培養人眼眶后成纖維細胞，觀察其對成纖維細胞增殖和透明質酸(HA)分泌的影響，為藥物治療甲狀腺相關眼病提供實驗室證據。

1 材料與方法

1.1 材料 雷公藤多甙藥片(中國制藥廠);MTT(SIGMA);RPMI1640(GIBCO);小牛血清(hyclone);0.25%胰蛋白酶(SIGMA);0.02%EDTA(實驗室配制);二甲基亞砜－DMSO(上海生工生物工程有限公司);磷酸鹽緩沖液－PBS(GIBCO 0.01M，pH7.2);青鏈霉素(SIGMA);6孔、24孔、96孔細胞培養板(GLOSTAR);酶聯免疫測定儀(BIO－RAD MODEL2550 EIA JAPAN)，CO2孵箱(美國 Forma scientific3336);B600型低速自動平衡離心機(白洋離心機廠);OLYMBUS照像顯微鏡由天津醫科大學醫學影像室提供;透明質酸放射免疫分析藥盒(北京北方生物技術研究所，批號:041120);SN－695B型智能放免γ測量儀。

1.2 方法 實驗標本取自海綿狀血管瘤手術中切除的眶后組織，共3例。將手術過程中切除的眶后組織進行成纖維細胞的原代培養，傳代，細胞鑒定，并觀察不同濃度的雷公藤多甙對成纖維細胞增殖和透明質酸分泌的影響。

1.3 統計學處理 采用SPSS11.5統計軟件，所有數據用表示，經正態分布和方差齊性檢驗，進行組間單因素方差分析。

2 結果

雷公藤多甙對眶成纖維細胞的抑制作用呈時間依賴性。而同一時間內，隨著藥物濃度的增加，抑制率(IR)增強，其對細胞的作用具有劑量依賴性和時間依賴性。雷公藤多甙對成纖維細胞分泌透明質酸也呈時間依賴性和劑量依賴性，見表1，表2。

表1 不同濃度藥物組作用不同時間后的細胞增殖(±s，n=10)

表1 不同濃度藥物組作用不同時間后的細胞增殖(±s，n=10)

注:同一時間，不同濃度組與對照組比較，*P＜0.05，ΔP＜0.01

分組 藥物濃度(μg/mL) 24h OD值 IR(%)48h OD值 IR(%)72h OD值 IR(%)0.225 ±0.010 － 0.312 ±0.010 － 0.398 ±0.011 －實驗組 0.625 0.233 ±0.011 －3.56 0.303 ±0.012 2.90 0.366 ±0.023* 8.031.25 0.191 ±0.016 15.11 0.285 ±0.013* 8.77 0.321 ±0.017Δ 19.312.5 0.137 ±0.007* 39.11 0.247 ±0.015Δ 20.90 0.228 ±0.019Δ 42.605.0 0.115 ±0.006Δ 48.89 0.189 ±0.011Δ 39.55 0.147 ±0.022Δ 63.0110.0 0.107 ±0.018Δ 52.44 0.130 ±0.021Δ 58.20 0.109 ±0.013Δ對照組072.70

表2 不同濃度藥物組作用不同時間后HA的含量(±s，n=10)

表2 不同濃度藥物組作用不同時間后HA的含量(±s，n=10)

注:同一時間，不同濃度組與對照組比較，*P＜0.05，ΔP＜0.01

分組 藥物濃度(mg/mL)24h 48h 72h對照組0 50.10 ±13.56 61.31 ±23.55 133.30 ±5.21實驗組 0.625 41.67 ±9.35 43.25 ±13.77 61.11 ±26.12Δ1.25 39.96 ±16.71 39.86 ±10.73* 49.57 ±4.50Δ2.5 39.76 ±9.34 36.26 ±2.90Δ 48.76 ±9.67Δ5.0 30.61 ±12.84* 35.18 ±5.44Δ 45.53 ±16.64Δ10.0 18.74 ±5.94Δ 30.82 ±13.83Δ 32.69 ±15.40Δ

3 討論

目前公認的TAO發病機制為其在內、外因素作用下引起甲狀腺損害，導致甲狀腺抗原的釋放，自身反應性T淋巴細胞被激活，激活的T淋巴細胞進入眼眶，并釋放大量的細胞因子，如IL－1，IFN－γ，TGF－β，TNF等，這些細胞因子作用于眼眶成纖維細胞，使其增殖及合成糖胺多糖(GAG)，引起眼眶組織的體積增加，另一方面使免疫調控蛋白如HLA－DR，ICAM－1，HSP－72表達增強，增強眼眶局部的自身免疫反應。同時激活的成纖維細胞又可分泌多種細胞因子，其中多數為炎性分子，與眼眶浸潤的淋巴細胞等分泌的細胞因子共同作用于眼眶組織，引起眼眶的炎性反應。成纖維細胞是TAO發病的靶細胞和效應細胞。在我們的實驗中，應用不同濃度的雷公藤作用于眶成纖維細胞，可見其明顯抑制眶成纖維細胞的增殖和透明質酸的分泌，并呈濃度和時間依賴性。雷公藤多甙具有較強的抑制CD4/CD8的功能，使CD4/CD8值下降。可能通過T輔助細胞減少，抑制T細胞增高，達到糾正T細胞亞群紊亂，使T細胞功能得到改善，由此調整免疫應答。實驗也發現其有促進腎上腺合成糖皮質激素以及增加腎上腺皮質功能的作用。可減輕水腫和炎性細胞浸潤，減輕血漿前列腺素E2含量和抑制肉芽組織增生。雷公藤多甙具有與糖皮質激素相似的免疫抑制作用，但無抑制下丘腦、垂體、腎上腺皮質軸的作用，故其副作用較糖皮質激素小。其臨床常見的副作用為腎功能、肝功能受損，血白細胞下降，血小板減少，月經失調，精子減少，胃腸道反應，皮膚色素沉著等。雷公藤多用于多種免疫相關性疾病的治療，如虹膜睫狀體炎、葡萄膜炎、白塞病。羅燕等[1]曾觀察雷公藤多甙片治療TAO的臨床療效，結果顯示，應用雷公藤多甙治療后患者球結膜水腫消失，眼瞼腫脹減輕，上、下瞼回縮均有不同程度的減輕，部分患者上瞼遲落消失，眼球突出度減少。B超顯示各條眼外肌的厚度均有不同程度的降低。王嵐[2]報道雷公藤多甙可以達到與激素治療相當的效果，對眼球突出有較好的治療效果，且不良反應少且輕。有報道提示雷公藤多甙小劑量多次用藥較安全而且療效較好[3]，故筆者認為在甲功正常的輕中度TAO患者中可使用雷公藤多甙以取得較好的療效。

[1]羅 燕，鄭大文，王 湘，等.雷公藤多甙片治療甲狀腺相關眼眶病變的臨床觀察[J].中國中醫眼科雜志，2002，12(5):95

[2]王 嵐.Graves眼病免疫抑制劑療效探討[J].浙江臨床醫學，2007，9(2):197

[3]李莉霞，金若敏，李化奎，等.雷公藤多甙多次給藥的免疫抑制作用及安全范圍的研究[J].中國新藥與臨床雜志，2006，25(4):248