羊膜移植術治療兔角膜堿燒傷治療的實驗研究

林玉華,曹麗輝,劉遠光

(佳木斯大學附屬第一醫院眼科,黑龍江 佳木斯 154003)

近年來隨著羊膜移植(Amniotic membrane transplantation,AM T)研究的不斷深入,許多研究者發現羊膜是一種透明、有一定韌性且無神經、血管和淋巴管的組織。羊膜有抗原性低,促進眼表上皮化,減輕炎癥反應、減少新生血管形成的作用。最近的研究發現細胞因子在角膜新生血管(corneal neovascularization,CNV)形成中發揮至關重要的作用,其中血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)已經被證實是 CNV的生長因子之一。羊膜有抗原性低,促進眼表上皮化,減輕炎癥反應、減少新生血管形成的作用。用羊膜修復眼角膜和角膜缺損區的創面可提供一個理想的基底膜,使其迅速上皮化及創口愈合。證實了 AM TT治療角膜堿燒傷等眼表疾病所致的角膜潰瘍具有良好的療效?？纱龠M角膜上皮化,抑制炎癥和新生血管,減輕纖維化。目前認為,單純 AM T對角膜內皮功能受損較輕的Ⅲ度燒傷效果較好,術后大部分角膜透明或僅留薄翳,很少有新生血管長入;對炎癥等原因導致內皮功能不正常的,AM T有助于其功能的恢復,但對角膜內皮損傷較重,內皮失代償的,單純 AM T效果較差,因此對于Ⅳ度燒傷特別是合并潰瘍和穿孔的,可以將 AM T作為重建眼表的第一步,雖不能恢復有用的視力但可以保存眼球,防止病情的進一步惡化,改善眼表微環境,為后期重建健康的眼表功能創造機會。但有關這些作用的生物學基礎尚不完全清楚。本實驗的目的在于觀察羊膜移植術對兔角膜堿燒傷后面積和透明度的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇健康新西蘭大白兔(佳木斯大學動物中心提供)48只。新鮮羊膜組織(購自婦嬰醫院 )。眼科手術顯微鏡,纖維器械,裂隙燈顯微鏡(蘇州醫療器械廠 )。

1.2 試驗方法

1.2.1 動物分組

健康成年兔 48只(雌雄不分),體重 2.5～ 3.5kg(由佳木斯大學動物實驗室提供)。隨機分為 4組,每組 12只。

1.2.2 動物模型的建立

新鮮羊膜的制備:取 HBsAg、衣原體、人體免疫缺陷病毒及梅毒均陰性的健康孕婦產后所獲得的胎盤。取材均在無菌操作下完成。用無菌生理鹽水沖洗干凈,置于青霉素 5×104u/L,鏈霉素 5×104u/L及二性霉素 B 2.5mg/L的生理鹽水中浸泡 10min,鈍性剝離,使羊膜與絨毛膜分離。將羊膜粗糙面與紙的粗糙面相貼,上皮面向上平鋪于粘貼手術巾的紙片上,附有羊膜紙片剪成 20mm×20mm大小,置于含青霉素100000u/L,鏈霉素 100000u/L的 DMEM培養基中,4℃冰箱中保存,備 12h內應用。

兔角膜堿燒傷模型的制作:將實驗兔按 1mL/kg體重在耳緣靜脈注射氯氨酮全麻藥后,固定于兔架上。將直徑15mm的濾紙浸于 1mol/L的氫氧化鈉溶液中 20秒鐘,在瓶口處沾干,放置在已點表面麻醉藥地卡因的兔右眼角膜中央3min后,除去濾紙 ,迅速用生理鹽水沖洗結膜囊 20min。

A組(對照組):制作模型后不給予羊膜移植治療。只用葡萄糖溶液 100mL沖洗結膜囊,然后點托吡卡胺散瞳,點氯霉素眼藥水,結膜囊內涂紅霉素眼膏,連續治療 3d。

B組于堿燒傷后 1h行羊膜移植術治療,用濾紙吸干結膜囊內水分,新鮮羊膜上皮面向下貼附于角膜,盡量做到緊密,間斷縫合八 8～ 10針 ,將羊膜固定于淺層鞏膜。術后滴抗生素眼液,涂眼膏,滴散瞳劑減輕炎癥反應。

C組于堿燒傷后 24h行羊膜移植治療,手術方法同前,術后滴抗生素眼液,涂眼膏,滴散瞳劑減輕炎癥反應。

D組于堿燒傷后 48h行羊膜移植術,手術方法同前,術后滴抗生素眼液,涂眼膏,滴散瞳劑減輕炎癥反應。

1.2.2 角膜著染面積觀察

10%熒光素鈉溶液進行角膜染色來判斷角膜上皮修復情況:根據著色面積分為 FI(+++ ),著色面積直徑 7～10mm;FI(++),著色面積直徑 5～ 7mm;FI(+),著色面積直徑為 3～ 5mm;FI(±),面積小于 3mm的淺著色。

1.2.3 角膜透明度觀察

根據資料標準并結合本研究的具體情況,制定如下分級標準:Ⅰ度:角膜完全透明。Ⅱ度:角膜輕度混濁,透過該區角膜尚可辨認虹膜紋理。Ⅲ度:角膜混濁,透過該區角膜不能辨認虹膜紋理,但可模糊辨認瞳孔緣。Ⅳ度:角膜混濁,虹膜及瞳孔緣不能視見。

1.2.4 HE法染色

第 3周角膜燒傷區炎癥反應,B組較 A組為輕,B組角膜燒傷區上皮呈病理性愈合,上皮增生活躍 ,但不均勻,細胞排列不規則,膠原性纖維排列紊亂,以前 1/3基質為著,纖維母細胞增多。后部基質的膠原纖維板層排列尚屬正常,無角膜細胞增多現象。相比之下,A組燒傷區角膜不但上皮未能修復,膠原纖維板層紊亂程度亦較顯著。C組較 B組為輕,角膜上皮愈合完整,膠原纖維板層排列稍欠規則,混濁區角膜上皮修復完全,但不規則,部分前彈力層缺損區上皮層較薄,膠原纖維層紊亂較透明區明顯,淺基質層內纖維母細胞增多。

1.3 統計方法

應用完全隨機設計多個樣本比較的 Kruskal-Wallis H檢驗對數據進行處理,以P＜0.05為差異有顯著意義。

2 結果

表 1 角膜染色面積比較(角膜個數,n=96)

表 2 角膜透明度觀察(角膜個數,n=96)

3 討論

進行角膜熒光素染色面積和角膜透明度觀察并分別將標本常規 HE染色。羊膜移植術組(C組)無論在炎癥反應,角膜熒光素鈉著染面積和透明度方面的治療效果都優于和對照組 (B組 ,A組,D組 )。

用羊膜修復眼角膜和角膜缺損區的創面可提供一個理想的基底膜,使其迅速上皮化及創口愈合[1]。證實了 AM T治療角膜堿燒傷等眼表疾病所致的角膜潰瘍具有良好的療效。證實了 AM T可促進角膜上皮化,抑制炎癥和新生血管,減輕纖維化[2]。目前認為單純 AM T對角膜內皮功能受損較輕的三度燒傷效果較好,術后大部分角膜透明或僅留薄翳,很少有新生血管長入;對炎癥等原因導致內皮功能不正常的,AM T有助于其功能的恢復,但對角膜內皮損傷較重,內皮失代償的,單純 AM T效果較差,因此對于四度燒傷特別是合并潰瘍和穿孔的,可以將 AMT作為重建眼表的第一步,雖不能恢復有用的視力但可以保存眼球,防止病情的進一步惡化,改善眼表微環境,為后期重建健康的眼表功能創造機會。

羊膜具有:基底膜作用[3],羊膜可產生多種生長因子,如:成纖維細胞生長因子、肝細胞生長因子、轉化生長因子-β(TGF-β)[4]等,有利于上皮細胞分化移行,增強上皮細胞粘附性,調節結膜上皮轉化為角膜型上皮細胞,并可作為支架組織部分替代角膜基質;羊膜可以治療化學傷自身免疫時引發的角膜自溶。羊膜移植術及硅膠粉作為一種新的方法治療角膜酸燒傷,較傳統治療方法更有效。此方法既可以減少有害物質的存留又可以提供角膜大量營養成份、抗炎成份、角膜上皮修復的支架,可較好的提高患者視力,是一種經濟、簡捷、有效的方法。

[1]Huang AJ,Tseng SC,Kenyon KR.Paracellular permeability of corneal and conjunctival epithelia[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,1989,30(4):684

[2]Ormerod LD,Garsd A,Reddy CV,et al.Dynamics of corneal epithelial healing after an alkali burn.A statistical analysis[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,1989,30(8):1784

[3]Shimazaki J,Shinozaki N,and Tsubota K.Transplantation of amniotic membrane and limbal autograft for patients with recurrent pterygium associated with symblepharon[J].Br J Ophthalmol,1998,82(3):235-240

[4]劉春民,徐錦堂.轉化生長因子β1對角膜堿燒傷后機體免疫細胞功能的影響 [J].眼科研究,2000,18(4):101-103