結(jié)締組織生長因子通過活化 ERK1/2通路促肌纖維母細(xì)胞增殖△

江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科 (鎮(zhèn)江 212001) 鄭金旭 田安國 黃震杰

在肺纖維化動物模型以及人類特發(fā)性肺纖維化(Idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)中 ,纖維化肺組織局部不僅結(jié)締組織生長因子(Connective tissue growth factor,CTGF)水平升高,而且還聚集了大量表達(dá)平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的肌纖維母細(xì)胞。以α-平滑肌肌動蛋白 (α-Smooth muscle actin,α-SM A)為標(biāo)志蛋白的肌纖維母細(xì)胞(Myofibroblasts)是結(jié)締組織損傷修復(fù)過程中一過性出現(xiàn)的介于成纖維細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞的一類細(xì)胞,具有極強(qiáng)的收縮、增殖和分泌細(xì)胞外基質(zhì)的能力,損傷修復(fù)完成后肌纖維母細(xì)胞也隨之消失,因此,正常組織沒有肌纖維母細(xì)胞。但在慢性疾病過程中肌纖維母細(xì)胞可以持續(xù)存在,導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)沉積并最終引起組織纖維化(Fibrosis)[1]。轉(zhuǎn)化生長因子 (Transforming grow th factor,TGF-β1)、結(jié)締組織生長因子(Connective tissue growth factor,CTGF)肌纖維母細(xì)胞與肺纖維化進(jìn)展過程關(guān)系密切。胡永斌等[2]研究表明 TGF-β1能誘導(dǎo)人胚肺成纖維細(xì)胞表型活化為肌纖維母細(xì)胞。本研究探討 CTGF促進(jìn)T GF-β1誘導(dǎo)活化的肌纖維母細(xì)胞增殖作用及其分子機(jī)制。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)材料 人胚肺成纖維細(xì)胞系 HLF,兔抗人 ERK1/2抗體,p-ERK1/2抗體購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司生物。 PD98059(ERK1/2活化特異性阻斷劑 )購自 invivogen公司。 CTGF、TGF-β1購自Pepro Tech Inc。α-SM A抗體武漢博士德生物技術(shù)有限公司。MT T華美生物技術(shù)公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 Western蛋白印跡法檢測α-SMA蛋白水平待 HLF細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期,無血清培養(yǎng)液饑餓24h后,加入 TGF-β1(15ng/ml)預(yù)處理細(xì)胞 48h后再分為對照組,CTGF刺激組(100ng/ml),PD98059+CTGF刺激組(50 μ M PD98059預(yù)處理 30 min后再加100ng/ml CTGF),單獨(dú) PD98059刺激組,以上各組均刺激 48h。用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞,用 Bradford法測定蛋白濃度,等量取 70 μ g總蛋白加入等體積無還原劑的 2倍 SDS上樣,用緩沖液混勻,沸水浴 5min。以10%SDS-PAGE電泳分離 (恒壓 80V約 100min),轉(zhuǎn)移蛋白至 PVDF膜上,5%無脂奶粉封閉液中室溫封閉 1h,與適量α-SM A抗體搖床孵育 (4℃,雜交過夜),PBST漂洗 4次 ,每次 10min,HRP標(biāo)記二抗(羊抗小鼠 )室溫孵育 1h,PBST漂洗 4次,每次 10min.ECL顯色,X膠片曝光。 TYPHOON掃描儀成像,采用Imagequant TL軟件分析蛋白條帶。實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3次。以β-actin為內(nèi)參。

2.2 MT T法檢測細(xì)胞增殖 待 HLF細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期,0.25%胰酶消化后制成細(xì)胞懸液,按1500/孔接種于 96孔培養(yǎng)板。培養(yǎng) 24h后,換無血清培養(yǎng)液饑餓 24h后,加入 TGF-β1(15ng/ml)預(yù)處理細(xì)胞48h后再隨機(jī)分為對照組:每孔加入含 1%小牛血清的培養(yǎng)液 200 μ l,CTGF刺激組(100ng/ml):每孔加入含CTGF(100ng/ml)的 1%小牛血清培養(yǎng)液 200 μ l,PD98059+CTGF刺激組:(50 μM PD98059預(yù)處理 30 min后再加入含 CTGF(100ng/ml)的 1%小牛血清培養(yǎng)液 200 μ l),單獨(dú) PD98059刺激組:每孔加入含 50 μ M PD98059的 1%小牛血清培養(yǎng)液 200 μ l。各組均刺激48h后每孔加入 5mg/mlMT T各 20 μ l,培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4h后,加入 DMSO室溫震蕩 20min后,在 Bio Tek酶標(biāo)儀 490nm處測定每孔的吸光度值。每組各設(shè) 4個復(fù)孔及 2個空白孔。

2.3 Western蛋白印跡法測定 p-ERK-1/2,ERK-1/2蛋白水平 TGF-β1(15ng/ml)預(yù)處理細(xì)胞48h后,再用 100ng/ml CTGF刺激細(xì)胞,分別于0min、15min、30min、60 min四個時間點(diǎn)檢測 p-ERK-1/2、ERK-1/2表達(dá)。用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞,等量取40μ l蛋白以 10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,轉(zhuǎn)移蛋白至 PVDF膜上,5% 無脂奶粉室溫封閉 1h,分別與抗 p-ERK-1/2抗體(1∶1000)、ERK-1/2抗體(1∶1000)4℃孵育雜交過夜,ECL顯色,X膠片曝光。TYPHOON掃描儀成像,采用 Imagequant TL軟件分析蛋白條帶,以 p-ERK-1/2與 ERK-1/2比值判斷結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3次。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 本組采用 SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料以表示,采用單因素方差分析,以 P＜0.05為有顯著性差異,P＜0.01為有極顯著性差異。

結(jié) 果

1 Western蛋白免疫印跡檢測α-SMA蛋白表達(dá)見圖 1～ 2。 TGF-β1預(yù)處理細(xì)胞后對照組有α-SMA蛋白表達(dá),CTGF刺激組細(xì)胞內(nèi)α-SM A蛋白水平明顯高于對照組(P＜0.01),PD98059+CTGF刺激組的α-SMA蛋白表達(dá)明顯低于 CT GF刺激組(P＜0.05),而單獨(dú) PD98059刺激組與對照組相比α-SMA水平也無明顯變化(P＞ 0.05),說明 PD98059本身對α-SMA表達(dá)無影響。

2 M TT法檢測細(xì)胞增殖 見附表。CTGF刺激組細(xì)胞增殖明顯與對照組相比(P＜0.01),PD98059+CTGF刺激組與 CTGF刺激組相比增殖明顯下降(P＜0.05),而單獨(dú) PD98059刺激組與對照組相比細(xì)胞增殖無明顯變化(P＞ 0.05),說明 PD98059本身對細(xì)胞增殖無影響。

3 Western蛋白印跡法測定 P-ERK-1/2,ERK-1/2蛋白水平 見圖 3。CTGF刺激細(xì)胞 15min時能明顯誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi) ERK-1/2磷酸化與 0min相比(P＜0.01)30min時達(dá)到高峰,60min時下降到基礎(chǔ)水平。

圖1 α-SM A蛋白在各組中相對光密度表達(dá) 1示對照組;2示 CTGF組;3示 PD98059+CTGF組;4示 PD98059刺激組

圖2 CTGF刺激 TGF-β1預(yù)處理的細(xì)胞對細(xì)胞內(nèi)α-SM A表達(dá)的影響及 PD98059對其阻斷作用

圖3 p-ERK,ERK相對光密度表達(dá)

附表 各組細(xì)胞增殖增殖情況(±s)

附表 各組細(xì)胞增殖增殖情況(±s)

注:*與對照組比較,P＜0.01;#與 CTGF組比較,P＜0.05

組 別 吸光度值對照組 0.272±0.021 CTGF刺激組 0.402± 0.030*PD98059+ CTGF刺激組 0.288± 0.023#PD98059刺激組 0.276± 0.026

討 論

肺纖維化的主要病理特征是間質(zhì)成纖維細(xì)胞,肌纖維母細(xì)胞大量增殖及細(xì)胞外基質(zhì)大量聚積,其中肌纖維母細(xì)胞是產(chǎn)生和分泌細(xì)胞外基質(zhì)的主要效應(yīng)細(xì)胞。另一方面肌纖維母細(xì)胞在纖維化部位持續(xù)存在還有利于異常的肺泡上皮重建,體外研究[3]表明,IPF中的肌纖維母細(xì)胞分泌血管緊張素肽,它能誘導(dǎo)鄰近肺泡上皮細(xì)胞凋亡。此外,IPF中的肌纖維母細(xì)胞還具有其他表型特征,如提高自身的遷移能力,增加自身的收縮性[4]。因此,肌纖維母細(xì)胞的存在如否和數(shù)量多少被認(rèn)為是預(yù)測慢性纖維化疾病預(yù)后的良好指標(biāo)。在肺組織纖維化慢性進(jìn)展過程中,肌纖維母細(xì)胞的來源既由組織局部成纖維細(xì)胞和肺泡上皮上皮細(xì)胞在各種炎癥因子刺激下不斷轉(zhuǎn)化而來,也可來源于肌纖維母細(xì)胞的增殖。胡永斌等[2]實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明 TGF-β1能夠誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌纖維母細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)在 TGF-β1誘導(dǎo)下,成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌纖維母細(xì)胞后,再以 CTGF刺激可以使α-SM A水平增加,M TT法進(jìn)一步證實(shí)CTGF是通過促進(jìn)這種轉(zhuǎn)化的肌纖維母細(xì)胞增殖而上調(diào)α-SMA蛋白。提示 CTGF和 T GF-β1在促進(jìn)肌纖維母細(xì)胞生成的作用環(huán)節(jié)不同,即 TGF-β1誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化生成肌纖維母細(xì)胞,CTGF促進(jìn)肌纖維母細(xì)胞增殖。本研究顯示 CTGF可促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的主要來源細(xì)胞—肌纖維母細(xì)胞增殖,說明 CTGF在肺纖維化疾病的發(fā)病環(huán)節(jié)中起重要作用。CT GF促肌纖維母細(xì)胞增殖的分子機(jī)制是值得我們深入了解的問題。絲裂素活化蛋白激酶(MAPK)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是細(xì)胞增殖與分化信號傳導(dǎo)的共同通路,是成纖維細(xì)胞等許多細(xì)胞中多種信號向核內(nèi)傳遞的共同途徑。其中 ERK1/2及其磷酸化連鎖反應(yīng)在有絲分裂細(xì)胞分化的過程中非常關(guān)鍵,是細(xì)胞轉(zhuǎn)型和增殖的關(guān)鍵酶。ERK1/2活化是很多細(xì)胞通過 G1限制點(diǎn)進(jìn)入 S期所必須的。我們通過觀察 CTGF對肌纖維母細(xì)胞內(nèi) ERK-1/2信號途徑的影響發(fā)現(xiàn) CTGF可以明顯活化 ERK-1/2;并且用ERK-1/2活化特異阻斷劑 PD98059可以明顯阻斷CTGF引起的細(xì)胞增殖和α-SM A增加。說明 CTGF促肌纖維母細(xì)胞增殖效應(yīng)是通過 ERK-1/2信號途徑介導(dǎo)的,這與 Yosimichi等[5]的 CTGF通過 Erk-1/2信號通路促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖的報道一致。說明阻斷CTGF的信號通路可以有效抑制 CTGF促肌纖維母細(xì)胞增殖效應(yīng)。本研究探討了 CTGF促進(jìn) TGF-β1誘導(dǎo)活化的肌纖維母細(xì)胞增殖作用及其分子機(jī)制,為CTGF成為干預(yù)肺纖維化的藥物靶標(biāo)提供了理論基礎(chǔ)。

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