術中放療對保乳患者傷口引流液內 GRO-1、VEGF的影響

劉小健 周士福 周洪偉 時偉峰 戴啟明 孫春雷 孟 東

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一,保乳手術已成為歐美國家治療早期乳腺癌的主要方法之一 ,術后全乳放射治療是目前早期乳腺癌保乳手術的標準治療[1,2],但是Vicini等研究結果表明保乳患者術后全乳照射不一定是必要的,采用電子射線的術中放療(21 Gy)原則上可以替代保乳術后的外部放療。同時 Barbara等[3]研究表明,保乳患者術中放療后 24 h內傷口引流液作為乳腺癌細胞生長的 1個微環境,對乳腺癌細胞的增殖、生長、運動有著一定的影響。本課題即對引流液內的生長相關性癌基因(growth-regulated oncogene-1,GRO-1)和血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)含量的變化做一研究,并分析兩者的相關性。

1 材料與方法

1.1 研究對象

2007年 6月至 2009年 9月我院乳腺中心收治的60例乳腺癌保乳手術患者,均為女性,年齡 35～50歲,平均 42.60歲,將 60例保乳患者隨機分為兩組,每組 30例。其中一組為對照組:單純行保乳手術;另一組為試驗組:行保乳手術并輔以術中電子射線照射。試驗組患者具體操作過程如下:所有行術中電子射線患者采用硬膜外連續麻醉,以便患者配合,同時照射過程中麻醉醫生通過加速器室內攝像系統監察患者。直線加速器室術前 1天用紫外線照射滅菌。手術者在專用手術室內將圓形鉛板置乳房后間隙,絲線縫合乳腺,再進一步游離乳腺淺面以便限光筒的放入,準備工作完善后,將患者及麻醉監護裝置推至隔壁加速器室,使用 Varian Clinic 23EX直線加速器,根據腫瘤大小及部位選擇平面或斜面相應直徑的限光筒(均為無菌狀態),應用限光筒后,加速器的電子線百分度劑量(percent depth dose,PDD)會有變化,根據我院實際測量的數據,為保證靶區乳腺表面達到 90%以上的處方劑量,我們應用 2～5mm的生理鹽水紗布作為組織等效填充物,放置在照射的乳腺表面。通過皮膚切口置入限光筒,皮膚及皮下脂肪位于限光筒外,在加速器工作人員的配合下固定限光筒裝置后,選擇 9Mev電子線,靶區處方劑量為 21 Gy,單次照射,時間約為 2～3 min。

1.2 標本采集

所有保乳患者切口處均放置潘氏引流管以方便引流液采集。待術后24 h用 20ml無菌針筒從潘氏引流管內抽取引流液,然后將引流液放置蘇州大學附屬第四醫院中心實驗室無菌離心管內,離心機 2 000轉/分,離心 10 min后取上清液,并將上清液存放至-70℃冰箱中,待實驗前半小時取出恢復至常溫。

1.3 試劑與儀器

人 GRO-1和人 VEGF的 ELISA試劑盒購自美國ADL公司,酶標儀由蘇州大學附屬第四醫院檢驗科提供檢測。

1.4 方法和步驟

操作方法及步驟嚴格按照人 GRO-1和人 VEGF試劑盒產品說明書進行。經過標準品的稀釋與加樣、溫育、配液、洗滌、加酶、2次溫育及洗滌、顯色等一系列步驟后,在 450 nm波長下依次測定各孔的吸光度(OD值)。

1.5 統計學處理

2 結果

2.1 GRO-1標準品曲線擬合圖及擬合方程

擬合方程:y=a+bx2+cx3+dx4+ex5(a=0.37123274,b=-054.453956,c=1942.2459,d=-4465.7715,e=3088.8425)

GRO-1標準品曲線擬合圖見圖 1。

圖1 GRO-1標準品曲線擬合圖

根據上述曲線方程計算出兩組患者 24 h傷口引流液內 GRO-1含量,對照組和試驗組GRO-1含量分別為(50.08±14.09)pmol/l和 (15.64±2.80)pmol/l,兩者比較有統計學意義(P＜0.01)。

2.2 VEGF標準品曲線擬合圖及擬合方程

擬合方程:y=a/(1+be-cx)(a=1850.0786,b=20.691958,c=6.9705137)

VEGF標準品曲線擬合圖見圖 2。

圖2 VEGF標準品曲線擬合圖

根據上述曲線方程計算出兩組患者 24 h傷口引流液內 VEGF的含量分別為(427.16±20.18)ng/l和(206.55±6.34)ng/l,兩者比較有統計學意義(P＜0.01)。

2.3 GRO-1表達與 VEGF表達的關系

對照組患者引流液內 GRO-1和 VEGF的含量分別為(50.08±14.09)pmol/l和(427.16±20.18)ng/l,兩者表達呈正相關性(γ=0.817,P＜0.01);試驗組患者引流液內 GRO-1和 VEGF的含量分別為(15.64±2.80)pmol/l和(206.55±6.34)ng/l,兩者表達也呈正相關性(γ=0.449,P＜0.05)。

3 討論

Paget等[4,5]首次提出了“種子和土壤”理論假設,“種子”我們可以認為就是術后瘤床內的殘瘤細胞,“土壤”即為術后的瘤床。目前保乳手術術后的復發灶大部分局限在手術切口瘢痕處,這一現象最常見的解釋是切口內殘余腫瘤細胞的存在[3],也即所謂“種子”的殘留,但是其中微環境成分的作用也是 1個不容忽視的因素。從哲學的角度來看,“種子”的存在可以認為是乳腺癌局部復發這一事件的內因,而“土壤”——“瘤床”內成分的改變即為外因,內因和外因共同作用加速事件的發生、發展。但是我們可以干擾其中的外因以此來抑制保乳手術患者局部復發這一事件的發展——ELIOT。

從國外的數據來看,2001年倫敦大學醫學院 25名接受術中放療患者的隨訪結果(中位隨訪 2年)表明,該組患者無明顯并發癥及無局部復發[6],2008年意大利米蘭歐洲腫瘤研究所公布了其 1999年 7月至2006年 12月經術中放療治療的 1246例(未進入隨機試驗)原發性乳腺腫瘤患者研究結果[7],隨訪 0.3～94.7個月(中位隨訪 26個月),24例(1.9%)局部復發,與常規全乳放療局部復發率相近,不高于常規全乳放療患者。這些研究結果表明了經過術中放療后,保乳患者局部的復發率控制效果取得了標準化術后全乳放射治療一樣的效果。

所以我們通過本次實驗,對其中微環境內成分的變化做一研究,以期望提供 1個新的理論依據來解釋為何也能起到和全乳放射治療一樣的局部復發控制效果。從實驗的結果來看,行 ELIOT的保乳患者“土壤”內的 GRO-1和 VEGF這兩者的含量發生了明顯的改變,其中可能的機制有:一是手術本來切除了腫瘤從而減少了腫瘤對 GRO-1和 VEGF的分泌;二是經過術中電子射線照射,破壞了 GRO-1和 VEGF的蛋白結構;從而減少了滲液內 GRO-1和 VEGF的含量,而 GRO-1和 VEGF這兩者與腫瘤的生長、遠處轉移、復發等有著密切聯系的。

GRO-1也稱 GRO-α,系統命名為 CXCL1,過去曾被稱為 MGSA(melanomagrowth stimulatory activity),對應于小鼠為 KC或 MIP-2(macrophage inflame matory protein一 2)基因。GRO家族是一類屬于 ELR-CXC族的趨化因子,除了 GRO-α外,還包括 GRO-β,GRO-γ(即 GRO-1,GRO-2,GRO– 3),GRO-α,GRO-β,GRO-γ相互比鄰,緊密連鎖。GRO家族在惡性腫瘤演進中的作用越來越受到重視。Folkman的研究表明腫瘤是典型的血管依賴性病變,缺乏血管形成時腫瘤生長受限[8]。而 GRO-1作為 GRO家族中重要的一員,除了能自分泌作用促進細胞生長除了能自分泌作用促進細胞生長,還能通過旁分泌作用促進腫瘤中新生血管的生長和轉移[9],同時 GRO-1還有促進腫瘤細胞增殖作用[10]、促進腫瘤細胞侵襲轉移作用[11]。

VEGF是腫瘤內血管生長的促進因子,它們過表達與腫瘤的發生、轉移及治療密切相關,是近年來發現的 1種內皮細胞分裂素,也是 1種糖蛋白,VEGF是以同源聚體的方式存在,其分子量為 34～45 kD。VEGF能夠特異性地與內皮細胞表面的Ⅲ型酪氨酸激酶受體Flt1和 KDR/Flk1結合,促進內皮細胞分裂、增殖并增加血管通透性,并上調 Bcl-2基因表達從而抑制腫瘤細胞凋亡,間接促進腫瘤細胞增殖和生長。因此,VEGF高表達對癌細胞生長、轉移有明顯的促進作用[12]。

在本次試驗中我們發現,經過過術中放療后的傷口引流夜內的 GRO-1含量與 VEGF的含量明顯低于術后放療組內的含量,因此,我們可以認為,經過術中放療以后的保乳患者瘤床內的成分發生了相應的改變,即所謂的“土壤”發生了一定的改變,而“土壤”內GRO-1含量的降低可以減慢腫瘤細胞的新生血管的形成、阻礙腫瘤細胞的增殖作用及侵襲轉移作用,VEGF含量的減少可以相應減弱 Bcl-2基因的表達,阻止腫瘤細胞增殖、生長及轉移作用。從對照組上看,GRO-1和 VEGF在表達上均呈正相關性,其中比較重要的原因是 GRO-1在腫瘤發生中的新生的形成呈劑量關系,并且在腫瘤發展中可以通過增強 VEGF促進血管化作用[13]。而通過術中電子射線照射后,GRO-1量的減少對腫瘤血管形成及轉移促進作用也相應減輕,從而進一步可以減輕 VEGF促進血管化的作用,使得原來有助于腫瘤在局部形成的“土壤”變成 1個不利用“種子”復發的微環境。同時 GRO-1和 VEGF在這一微環境內的表達量均有所明顯下降,并且兩者之間的表達也呈相關性,一方的減少也引起了另一方的減少,兩者同時的表達下調使得在減少腫瘤轉移、復發有了一定協同作用,這也許可能成為解釋局部復發率下降的 1個很重要的原因,并且也在一定程度上支持了在保乳手術中術中放療這一技術的可行性,而這對于廣大乳腺癌患者來說毫無疑問是 1個福音,同時術中放療既可以減少對皮膚、皮下組織及對側胸壁和肺的射線損傷,避免了大多數患者不宜接受長期術后放療,縮短了患者住院時間及術后放療劑量,減少了放療的費用。

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