辛伐他汀抑制血管平滑肌細胞增殖的可能表遺傳新機制

謝靜 李曉瓊 王樹人 李麗娟

(1.四川省第四人民醫院病理科,四川 成都 610016;2.四川大學華西醫學中心病理生理學教研室,四川 成都 610041;3.貴州省遵義醫學院病理生理教研室,貴州 遵義 563003)

3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶 A(HMG-CoA)還原酶抑制藥(他汀類)是目前臨床上應用最為廣泛的調血脂藥物。近年來的大量研究提示,他汀類除調脂作用外,還具有一系列調脂外作用,可能在動脈粥樣硬化和冠心病的防治中占有重要地位。有研究顯示,脂質和脂蛋白成份具有直接調控染色質結構和基因表達的功能[1],如 VLDL可誘導平滑肌細胞的增殖,膽固醇、氧化、糖基化脂蛋白促進動脈壁的纖維化等[2]。但在基因水平,脂質成份的這些影響多不至于引起基因突變,而更可能是通過表遺傳機制引起基因的表達異常。因此,調脂藥物也可能在表遺傳水平通過對基因表達調控的影響進而發揮抗動脈粥樣硬化的功效。

多梳基因(Polycomb group genes,PcG)的表達和功能改變目前被認為是一個非常早期的環節。PcG是一個在機體發育過程中控制許多重要基因活性的基因家族,Polycomb復合物對于胚胎發育和不同譜系基因抑制及長期基因沉默是必不可少的的主要組份,并與腫瘤干細胞的發育密切相關。As病損中VSM C的增殖與良性腫瘤增殖具有高度相似的單克隆性,因此,誘發VSMC增殖的早期基因調控中,很可能會有PcG家族成員的改變。Bmi-1基因屬于PcG家族的PCR1,與多種干細胞的增殖密切相關。血管平滑肌細胞的表型轉換和異常增殖是動脈粥樣硬化的病理生理基礎,而多梳基因Bmi-1表達的變化在VSMC的表型轉換和增殖中發揮重要的調控作用,且是其中的早期基因事件[3]。血管平滑肌細胞在體外培養至第四代時已經發生了明顯的表型轉換[4],因此本研究通過檢測辛伐他汀對體外培養的第四代血管平滑肌細胞多梳基因Bmi-1的表達及其對細胞增殖、凋亡、周期的影響,以觀察調脂藥物是否可以在表遺傳水平發揮作用,為辛伐他汀的作用機制提供新的解釋。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

CO2孵箱(Heraeus,Germany);紫外分光光度計(Perkin Elmer LamBda Bio40,Germany);PCR儀(Biometra,Germany);倒置相差顯微鏡(Nikon,Japan);pH測定儀(4330,JENWAY Ltd,UK);電泳儀和酶標儀(BIO-RAD,America);流式細胞儀(ELITE EST coulter,America);凝膠成像系統(DBT-08,EEC公司)。辛伐他汀、DM EM/F12培養基、小牛血清、0.25%胰蛋白酶及RT-PCR試劑盒(成都博瑞克生物技術有限公司);四甲基偶氮唑鹽(Methyl thiazolyl tetrazolium,MT T)和PI染料(Sigma公司);AnnexinⅤ/PI試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞分離與培養

取8w齡雄性SD大鼠,體重120g左右,購自四川中藥研究所,常規處死,剖胸取出胸主動脈。分離血管周圍組織,縱向剖開血管,分離中、外膜。將中膜剪成 1 mm×1 mm×1 mm組織塊。添加含有20%小牛血清的 DMEM/F12培養基,5%CO2、37℃培養箱培養。7-9d后細胞達匯合狀態時,用0.25%胰蛋白酶消化,傳代。取第1～4代細胞用于實驗。

1.2.2 實驗分組

實驗分兩組：對照組和辛伐他汀處理組。對照組：正常生長的第四代平滑肌細胞;辛伐他汀處理組：不同濃度辛伐他汀(5,10,20,40μ mol?L-1)作用第四代平滑肌細胞 12、24和36h。

1.2.3 逆轉錄聚合酶鏈反應檢測Bmi-1 mRNA

用Trizol試劑提取各組大鼠VSMC總RNA,用逆轉錄酶和Oliga(dT)20引物合成cDNA。Bmi-1引物序列上游為5'-AGA GAA GCC AAA GGA GGAGGT-3',下游為 5'-GAT GAT TTC CGA GGT CTACTG G-3',擴增長度為494bp;內參L-19引物序列上游為5'-CTG AAG GTC AAA GGG AAT GTG-3',下游為 5'-GGA CAG AGT CT T GAT GAT CTC-3',擴增長度為194bp。兩對引物均加入25μ L反應體系中,PCR反應條件為 94℃變性45s,56℃復性45s,72℃延伸60s,共35個循環。RT-PCR產物經20g?L-1瓊脂糖膠分離后凝膠成像系統攝影,用Gel-pro凝膠定量分析軟件分析RT-PCR產量。

1.2.4 細胞形態觀察

取對數生長期細胞,以每孔2×105的量接種于6孔板,4h后加入終濃度 0、5、10、20、和 40μ mol? L-1的辛伐他汀,藥物處理后12、24和36h在倒置顯微鏡下連續觀察細胞形態學變化并拍攝記錄細胞形態。

1.2.5 四甲基偶氮唑鹽法測定細胞增殖活力

分別收集對數生長期細胞,用胰酶消化,制成細胞懸液(5×1012? L-1),加入 96 孔培養板,每孔 200μ L,置 5%CO2、37℃培養箱中,培養24h后吸出培養液,按分組設計加入不同濃度(0、5、10、20、和 40μ mol? L-1)辛伐他汀,分別培養 12、24和36h,在終止培養前4 h每孔加入20μ L MT T(5g?L-1),置5%CO2、37℃培養箱中作用4h,除去上清液,加入 150μ L DMSO溶解,平板振蕩儀振蕩10min,酶標儀490nm波長檢測各孔吸光度值。以只加培養液不含細胞的培養孔為空白對照組。

1.2.6 細胞周期及凋亡檢測

選取 24h 作 為時 間點,加 入不同 濃度(0、5、10、20、和40μ mol?L-1)辛伐他汀培養細胞后,用 0.25%胰蛋白酶消化收集細胞,800 r?min-1離心5min,棄去培養液,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌1次,離心去PBS,加入冰預冷的 70%乙醇固定,4℃冰箱中保存。染色前以PBS離心沉淀去除固定液,加入PI染色,4℃避光30min,上機行流式細胞術檢測細胞周期變化。同樣用胰酶消化收集不同濃度組辛伐他汀液培養24 h后的細胞,按照AnnexinⅤ/PI試劑盒說明進行操作,流式細胞術分析細胞凋亡情況。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 辛伐他汀對第四代大鼠血管平滑肌細胞Bmi-1 mRNA表達水平的影響

采用RT-PCR檢測Bmi-1的mRNA表達水平。不同濃度辛伐他汀作用細胞12、24、36h后,Bmi-1的 mRNA表達水平隨作用濃度的增加和時間的延長呈下降趨勢(P＜0.05,n=3)。(見圖1)

2.2 細胞形態學改變

加藥前對照組與辛伐他汀加藥組平滑肌細胞數量和形態基本一致;加藥12、24和 36h后,對照組細胞生長良好、數量隨生長時間增長而增多,細胞大小均勻、形態一致并呈梭形,高倍鏡下可見細胞染色質疏松、胞質豐富。加藥組細胞培養 12h后,辛伐他汀低濃度組與對照組相比變化不明顯,40μ mol?L-1組可見細胞數量減少、細胞大小和形態不均,部分細胞胞體腫脹變圓。藥物作用24和36h后,各實驗組均可見細胞數量明顯減少,細胞大小不一,形態不規則,高倍鏡可見細胞核固縮、胞質減少以及胞質內出現空泡,大部分細胞脫壁呈半懸浮狀態,以上細胞數量及形態改變隨藥物作用時間的延長和濃度的增加而更明顯(見圖2)。

2.3 辛伐他汀對平滑肌細胞生長的抑制作用

M TT試驗顯示,辛伐他汀作用12、24和36h后,各濃度組均出現了不同程度的生長抑制(P＜0.05,n=14;見圖3)。

圖3 不同時間和濃度辛伐他汀對VS MC s的A490值的影響

2.4 細胞凋亡及細胞周期的檢測

經 5、10、20、40μ mol?L-1的辛伐他汀作用 24h 后,平滑肌細胞凋亡率明顯增加。細胞周期檢測顯示G0/G1期細胞比例明顯增加,而S期細胞比例明顯降低,顯示細胞主要阻滯于G0/G1期,且隨著濃度的增高及時間的延長,細胞凋亡和周期阻滯越明顯(見表1,圖4)。

3 討論

近年來,隨著人們生活水平的提高和工作節奏的加快,心腦血管病的發病率和病死率都呈明顯的上升態勢。動脈粥樣硬化是心腦血管病的主要病理基礎,引起動脈粥樣硬化和冠心病的危險因素很多,其中脂質代謝紊亂尤為重要。

表1 不同濃度辛伐他汀作用24h后對VSMCs凋亡及細胞周期的影響(,n=3)

表1 不同濃度辛伐他汀作用24h后對VSMCs凋亡及細胞周期的影響(,n=3)

▲P＜0.05與對照組比較;★P＜0.05與不同濃度組間比較。

組別 凋亡率(%) G0/G1 S空白對照組 8.30±0.95 56.40±3.20 38.67±3.30辛伐他汀5μ mol?L-1組 10.83±1.36 62.10±1.95▲★ 28.53±5.50▲★辛伐他汀10μ mol?L-1組 15.27±2.85▲★ 67.97±2.72▲★ 21.53±3.69▲辛伐他汀20μ mol?L-1組 19.90±0.26▲★ 73.20±1.22▲ 15.87±2.99▲辛伐他汀40μ mol?L-1組 25.50±1.99▲★ 75.43±1.19▲ 12.50±1.40▲

圖4 24h不同濃度辛伐他汀處理后細胞周期的變化

3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制藥(他汀類)是目前臨床上應用最為廣泛的調血脂藥物。HMGCoA還原酶是細胞內甲羥戊酸(M VA)合成途徑的限速酶,其催化產物MVA及下游產物參與細胞膜構成、糖蛋白合成、電子傳遞、細胞內信號轉導及細胞周期進展等重要的生物學功能[5]。他汀類藥物通過對該酶特異性抑制作用,使HMG-CoA不能轉變成MVA,從而阻斷膽固醇的合成,降低血膽固醇的水平,已普遍用于臨床治療高脂血癥。近年來的大量研究提示,他汀類除調脂作用外,還具有調脂外作用,主要包括改善內皮功能、抑制平滑肌細胞的增殖和聚集、誘導凋亡和抑制炎癥反應,減緩斑塊的形成,減小斑塊大小及穩定斑塊等作用[6]。

他汀類藥物能通過多種途徑抑制細胞增殖,如：抑制細胞內膽固醇的合成,使質膜的構成比例變化,導致細胞通訊連接子的構象或功能改變[7];破壞細胞內鈣穩態[8];下調細胞外信號調節激酶活性[9];增加表達周期素依賴性蛋白激酶抑制因子,導致細胞在G0/G1阻滯[10]。他汀類藥物誘導凋亡的機制主要在于通過影響M VA途徑而發揮作用：當MVA代謝產物水平下降時,關鍵信號轉導蛋白的異戊烯化受阻,引起調控細胞凋亡的一系列分子表達改變,包括原癌基因和抑癌基因的產物,從而影響凋亡信號級聯反應,誘導細胞凋亡[11]。

雖然調脂治療作用可解釋臨床上應用他汀類獲得的較多益處,但更多研究支持他汀類藥物具有調脂以外的臨床益處,他汀類的非調脂作用可能在動脈粥樣硬化和冠心病的防治中占有重要地位。辛伐他汀除了通過以上途徑引起細胞的增殖抑制和凋亡外,是否在表遺傳方面發揮作用尚未見報導。

本研究結果發現：在使用安全用藥濃度范圍內的辛伐他汀作用于發生表型轉換的平滑肌細胞后,能明顯降低Bmi-1基因的表達,同時抑制細胞增殖,促進凋亡,將細胞周期阻滯在G0/G1期。這表明辛伐他汀確能通過影響表遺傳調控過程發揮抗血管平滑肌細胞增殖的作用,從而揭示了辛伐他汀抗動脈粥樣硬化的另一新的作用機制。

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3 謝靜,李麗娟,王樹人,等.體外培養的平滑肌細胞多梳基因Bmi-1的表達變化及其與細胞增殖和細胞周期的關系[J].中國動脈硬化雜志,2009,17(1)：43-47.

4 王生蘭,蘇娟,徐一洲,等.大鼠血管平滑肌細胞體外培養的表型轉換及表型鑒定[J].中國動脈硬化雜志,2008,16(4)：268-272.

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