內毒素對大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞的損傷作用

楊華 侯勇 唐云安

(四川中醫藥高等專科學校基礎部生理教研室,四川 綿陽 621000)

急性肺損傷(Acute lung injury,ALI)是嚴重的休克、感染、創傷和中毒等多種因素所導致的急性彌漫性肺泡和肺血管內皮細胞的損傷,嚴重階段即為急性呼吸窘迫綜合征(Acute respiratory distress syndrome,ARDS),死亡率高達40～60%。肺泡Ⅱ型上皮細胞(Alveolar type II cell,AT-II)損傷是其發病過程中的重要環節之一。AT-Ⅱ是肺泡表面一類重要的細胞群體,合成和分泌肺表面活性物質,補充和分化肺泡Ⅰ型上皮細胞,修復肺泡上皮、肺水轉運、局部免疫等多種重要生理功能,對維持肺泡結構和功能有重要意義[1]。該細胞損傷是ALI發病過程中的重要環節之一。脂多糖(LPS)是內毒素的主要生物活性成分,具有極強的生物活性,肺是內毒素的主要靶器官之一。現已明確革蘭陰性菌感染、內毒素血癥是ALI主要致病原因之一,但是LPS是否對AT-Ⅱ有損傷作用還存在較大爭議,我們擬通過動物實驗證實LPS對AT-Ⅱ的損傷作用,從而進一步揭示ALI的發病機制。

1 材料和方法

1.1 材料 成年SD大鼠 18只,200～250g,雌雄各半,由四川大學華西醫學中心實驗動物中心提供,動物合格證號：SCXK(川)2005001;LPS(Sigma);堿性磷酸酶(AKP),乳酸脫氫酶(LDH),丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所);磷標準溶液由四川大學華西醫學中心預防系營養與食品衛生學教研室提供;7252C型紫外可見分光光度計(上海第三分析儀器廠生產)。

1.2 方法

1.2.1 動物模型 18只SD大鼠隨機分為2組：對照組以及LPS模型組(n=9),分別經頸外靜脈導管注入等容積生理鹽水以及LPS 2 mg?kg-1復制大鼠急性肺損傷模型。

1.2.2 手術及標本采集 大鼠腹腔注射200g?L-1烏拉坦5mL?kg-1麻醉后固定于鼠板,沿頸部正中切開皮膚,分離一側頸外靜脈,插入導管給藥。給藥后4h行頸椎脫臼處死并行氣管插管術,以4℃生理鹽水20ml?kg-1進行支氣管肺泡灌洗,連續3次,取第1次灌洗所得肺泡灌洗液(BALF)0.2ml用于表面張力的測量;收集所有BALF并記錄BALF回收量達到90%,1000 r?min-1離心 10min,取上清1.4ml用于測AKP、MDA、LDH和總蛋白(TP)等,剩余上清用于磷脂的提取。

1.2.3 肺組織的光鏡觀察 取右肺下葉,以40ml?L-1甲醛固定,石蠟包埋切片,HE染色,光學顯微鏡觀察。

1.2.4 BA LF中 AKP、MDA、LDH和 TP的測定 根據試劑盒說明采用放免法測定BALF中AKP、MDA和LDH的含量,采用考馬斯亮藍G2250染色法測定TP含量。

1.2.5 總磷脂(TPL)的測定 采用Bartlett法[4]略有改進。BALF中加入2倍體積的氯仿-甲醇(2∶1,V/V)萃取液,震蕩1min,2500 r?min-1離心 10min,棄上層液體但不棄界面雜質,加入1/4體積的甲醇-水(1∶1,V/V)萃取液,震蕩 1min,2500 r?min-1離心10min,棄去上層液及界面雜質,氮氣吹干,-20℃保存待測。將TPL加入1ml高氯酸加熱,溫度由低到高逐漸上升,直至顏色由黑變白后繼續加熱蒸干。磷鉬藍比色法測定樣本中無機磷含量,根據磷脂中磷含量約為4%算出磷脂含量,再計算出每公斤體質量的磷脂含量。

1.2.6 表面張力的測定 用毛細管法測定肺泡BALF表面相對張力,然后根據拉普拉斯方程σ=rρ g(h+r/3)/2計算出BALF的表面張力,以此來反映PS的含量及功能。其中,σ為表面張力(單位為N?cm-1),r為毛細管的半徑,ρ為液體密度,g為重力加速度,h為液體上升高度。

2 結果

2.1 LPS對肺組織的損傷作用

LPS可升高BALF中TP含量、MDA含量以及LDH活性(見表1)。光鏡下可見LPS組大鼠肺間質較對照組明顯增寬,有白細胞浸潤,肺泡萎陷、肺不張,肺泡腔偶見紅細胞,表現為間質性肺水腫(圖1)。

表1 脂多糖對肺組織及肺泡Ⅱ型上皮細胞的損傷作用(±s,n=9)

表1 脂多糖對肺組織及肺泡Ⅱ型上皮細胞的損傷作用(±s,n=9)

＊模型組與對照組比較P＜0.05;＊＊模型組與對照組比較P＜0.01。

組別 對照組 模型組LDH(ukat?L-1) 4.7±1.9 8.2±1.9＊TP(g?L-1) 29±16 85±31＊＊MDA(μ mol?L-1) 1.3±0.3 2.1±0.8＊AKP(nkat?L-1) 102±81 256±101＊＊表面張力(mN?m-1) 19.60±2.5 23.12±2.8＊TPL(μ g?kg-1) 432±43 370±57＊

2.2 LPS對AT-Ⅱ的損傷作用 LPS可使BALF中AKP活性升高近4倍,使BALF中TPL含量明顯下降,表面張力明顯升高(表1)。

圖1 大鼠肺組織的病理改變

3 討論

革蘭氏陰性菌感染、內毒素血癥是引發急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征的常見原因。正常生理情況下,AT-II主要分泌大量的肺表面活性物質參與肺組織成熟和肺的正常生理功能,其損傷是ALI/ARDS發病過程中的重要環節之一。ALI時LPS是否對AT-Ⅱ有損傷作用還存在較大爭議。本研究發現,頸外靜脈注射LPS后大鼠肺組織出現明顯肺損傷病理形態變化,LPS可使BALF中TP含量升高,表明肺泡滲出增加;LDH是胞內酶,LPS組BALF中LDH活性增加表明細胞損傷加重;LPS組BALF中MDA含量升高,提示脂質過氧化作用增強。上述4項指標變化符合急性肺損傷表現,表明LPS性急性肺損傷模型復制成功。AKP是A T-Ⅱ的特異性分化標志,當AT-Ⅱ損傷時被釋放入BALF,LPS使BALF中AKP活性增強,表明其對AT-Ⅱ有損傷作用;磷脂是PS的主要成分,TPL能反映PS含量變化,我們利用定磷法測量BALF中TPL含量,結果表明LPS可使BALF中TPL含量降低;表面張力反映了PS降低肺泡表面張力的功能,是AT-Ⅱ合成、分泌PS的質和量的綜合體現。綜合TPL及表面張力的變化,表明LPS可以抑制PS的合成、分泌,其機制可能為內毒素血癥時肺血流阻力增加,肺組織缺血、缺氧,引起 AT-Ⅱ損傷,進而影響PS的合成、分泌;也可能是LPS對AT-Ⅱ有直接損傷作用[2],進而使PS合成和分泌減少,具體作用機制尚有待于進一步研究。另外LPS導致AT-II損傷后可能還會引起合成肺表面活性物質蛋白(Surfactant protein,SP)能力下降[3],也有待進一步研究。

1 Adamson IY,Young L.Alveolar typeⅡcell growth on pulmonaryendothelial ex tracellular matrix[J].Am J Physiol,1996,270(6 Pt 1)：1017-1022.

2 許峰,何勇,匡鳳梧,等.急性肺損傷大鼠肺表面活性物質及肺表面活性物質蛋白的研究[J].重慶醫科大學學報,2004,29(2)：131-133.

3 劉靜,王正暉,何立英,等.急性肺損傷對大鼠肺表面活性物質蛋白C合成的影響[J].中國急救復蘇與災害醫學雜志,2008,3(2)：79-81.