慢性嗎啡成癮小鼠海馬中RACK1對CREB表達水平的影響＊

謝一舟 萬莉紅 蘇嵐 汪宇輝 劉延友 朱雨 王正榮△

(1.四川大學時間生物學衛生部重點實驗室;2.四川大學華西基礎與法醫學院藥理教研室,四川 成都 610041)

藥物成癮是腦內相關核團和細胞在藥物反復作用下發生適應性變化的時間依賴過程。藥物成癮過程與學習記憶過程可能存在相同的神經生物學基礎。行為學實驗表明二者作用于相同的腦區,學習記憶過程中起關鍵作用的相關腦區(例如,海馬)參與成癮藥物的強化效應,最終通過cAM P反應元件結合蛋白(CREB,cAMP-response element binding protein)調控相應的靶基因改變細胞的可塑性[1]。CREB是目前研究最多的與成癮記憶密切相關的分子機制之一[2],大多數成癮藥物都可以通過直接或間接途徑增加多巴胺的釋放,然后通過作用于D1受體增加cAM P的釋放從而活化PKA,使CREB磷酸化調控靶基因的轉錄,調節成癮藥物的行為效應[3]。

本實驗我們試圖通過對與研究學習記憶密切相關的腦區海馬中CREB的mRNA以及蛋白表達與RACK 1 mRNA以及蛋白表達的關系,探求干擾RACK 1對慢性嗎啡成癮小鼠可能的治療作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

雄性ICR小鼠,4～6W,60只。控制飼養及實驗環境條件(溫度：22℃、濕度：55%、光照循環12：12),自由進食進水。

1.1.2 試劑

shRACK1和空質粒由本實驗室汪宇輝博士合成,鹽酸嗎啡(四川醫藥總公司),Trizol(上海英俊生物技術有限公司),RT-PCR試劑盒(大連寶生物工程有限公司),引物序列由上海英俊生物技術有限公司合成,序列見表1。

表1 引物序列

1.2.1 慢性嗎啡成癮小鼠模型建立

實驗前小鼠自由活動3d,確定小鼠的天然偏愛,并測定其CPP值。 第4d開始,以 2d為一周期,第 1d,10：00注射嗎啡(MIC MIR,10mg?kg-1)或者生理鹽水(CONC),并將小鼠置于白側適應0.5h。次日10：00均注射生理鹽水,并將小鼠置于黑側0.5h,每天 16：00分別注射 shRACK1(M IR)和空質粒(MIC,CONC)。持續8d,重復4周期后,進行CPP測試。

1.2.2 RT-PCR檢測RACK 1、CREB mRNA的表達

處死小鼠,快速取腦組織,冰上分離海馬組織,Trizol法提取組織總 RNA,分光光度計鑒定總 RNA。采用半定量RTPCR特異性擴增RACK 1和CREB mRNA,分析其表達水平。

1.2.3 免疫組化檢測RACK1、CREB蛋白的表達

用4%的甲醛溶液將海馬組織標本固定48h,等級脫水后石蠟包埋,切片。石蠟切片常規脫蠟,3%H202室溫孵育15min,以阻斷內源性過氧化物酶,熱抗原修復10min,室溫冷卻30min。10%正常山羊血清封閉15min,滴加1：100稀釋的一抗RACK1和BDNF,4℃過夜,生物素化二抗 37℃孵育 15min,滴加辣根酶標記鏈酶卵白素工作液,37℃孵育15min,DAB顯色劑顯色5min,蘇木素復染,封片。采用盲法請有經驗的病理科醫生對切片進行觀察并作半定量分析,以胞漿內出現棕黃色顆粒為陽性細胞,每張切片在×400下隨機取10個視野,根據細胞染色的深淺和視野中顯色細胞所占的比例評分,兩項評分的乘積作為積分數。

1.3 統計分析方法

2 結果

2.1 shRACK1對小鼠CPP的影響

給藥前各組在白箱停留時間差別均無統計學意義(p＞0.05)。建立模型后,B：空質粒+嗎啡組(MIC)與A：空質粒+生理鹽水組(CONC)相比,小鼠在白箱內停留時間明顯增加(見圖1,＊p＜0.05);C：RACK1干擾質粒+嗎啡組(MIR)與空質粒+嗎啡組(MIC)相比,小鼠在白箱內停留時間明顯減少(見圖1,#p＜0.05)。

圖1 各組小鼠條件性位置偏愛測試

2.2 shRACK1對小鼠海馬RACK 1和CREB mRNA表達的影響

空質粒+嗎啡組(MIC)海馬中RACK 1和CREB mRNA的表達增高;而shRACK1+嗎啡組(M IR)海馬中 RACK 1和CREB mRNA的表達明顯降低(見圖2A)。經RT-PCR所得條帶的(OD)值,,計算 Rtime1=ODRACK1/ODβ-actin,Rtime2=ODCREB/ODβ-actin。檢測出與 MIR和CONC組相比,MIC組中RACK 1和CREB mRNA表達明顯增高(p＜0.05)(見圖2B)。

2.3 shRACK1對小鼠海馬RACK1和CREB蛋白表達的影響

RACK1和CREB在生理鹽水對照組海馬的齒狀回和CA1區呈現弱陽性表達,shRACK1+嗎啡組(MIR)海馬的齒狀回和CA1區呈現強陽性表達,而RACK1干擾質粒+嗎啡組(MIR)小鼠海馬的齒狀回和CA1區表達明顯降低,呈現弱陽性(見圖3)。

3 討論

CREB是分子量為43KD的蛋白質,定位于細胞核內,為DNA活性轉錄因子家庭中的成員之一,它能被蛋白激酶 A(PKA)磷酸化,是大腦內一種主要的轉錄調節因子。急性給藥,藥物可通過不同機制使相關腦區多巴胺(DA)含量增加,從而抑制腦內多種類型神經元內環磷酸腺苷(cAMP)酶活性[4-7]。而慢性反復給藥,腦內多種核團特別是邊緣中腦多巴胺系統相關核團則發生持續的對抗性適應反應,包括cAM P信號通路、阿片類受體和DA受體活性、多種神經元之間遞質活動的相應變化[8-13]。

早期的藥物成癮研究發現,急性嗎啡使用會導致藍斑和伏隔核的p-CREB水平降低,然而這種效應在慢性嗎啡成癮時徹底CREB磷酸化的調節作用可能是阿片類物質導致藥物成癮產生的基因表達變化的分子信號通路的一個重要組成部分。慢性嗎啡給藥后,NAc中CREB的免疫活性降低,NAc中注射反義寡核苷酸后NAc中CREB免疫活性呈特異且持續的降低,反義寡核苷酸可以部分拮抗嗎啡的效應,提示CREB在神經系統中可以自主調節cAM P通路[14-15]。CREB的調節及隨后的基因表達的變化可能是阿片類藥物引起的細胞內長期適應性變化的基礎。急慢性嗎啡給藥后CREB控制的基因的表達卻不同[16]。通過對信號級聯反應通路的研究發現,慢性嗎啡給藥導致不同腦區神經細胞cAM P信號轉導通路功能上調,PKA催化亞單位上調;同時CaM-CamK信號轉導通路激活,鈣依賴性蛋白激酶上調,使得細胞內的CREB磷酸化而激活,與CREB結合蛋白(CRE)的結合活性增加,磷酸化后的CREB可以和CBP結合,共同作用于含有CRE調節序列。

本實驗建立慢性嗎啡成癮小鼠模型,用RT-PCR技術檢測RACK1和 CREB mRNA和蛋白表達水平,結果顯示干擾RACK1能夠使CREB表達量降低。從而確定了RACK1與慢性成癮之間的關系以及RACK1干擾質粒慢性成癮的作用,并揭示了其作用機制在于阻斷了細胞內的RACK1-CREB通路。

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